喹賽多對(duì)C2C12肌管基因與蛋白表達(dá)的影響研究.pdf

1、喹賽多作為新型喹噁啉類(lèi)抗菌促生長(zhǎng)飼料添加藥物，與同類(lèi)藥物相比，具有更高的安全性。喹賽多對(duì)多種家畜家禽及水產(chǎn)動(dòng)物均有較好的促生長(zhǎng)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，喹賽多可提高豬體內(nèi)循環(huán)GH和IGF-1的含量，能夠誘導(dǎo)豬肝細(xì)胞IGF-1的表達(dá)量上調(diào)。GH和IGF-1位于動(dòng)物激素生長(zhǎng)軸中，可直接或間接的作用于肌肉組織，使動(dòng)物整體表現(xiàn)出生長(zhǎng)。那么喹賽多是否也能夠直接調(diào)控直觀體現(xiàn)動(dòng)物生長(zhǎng)的肌肉組織呢？探明喹賽多對(duì)肌肉組織有無(wú)直接作用，若有作用又是通過(guò)何

2、種機(jī)制發(fā)揮作用，這為進(jìn)一步探討喹賽多促生長(zhǎng)機(jī)制提供了理論依據(jù)和新思路。本研究以小鼠成肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞系分化所形成的肌管為研究模型，首先選取了喹賽多作用細(xì)胞的最佳濃度和時(shí)間，然后通過(guò)基因芯片技術(shù)和雙向電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選出了喹賽多影響下差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)，并對(duì)喹賽多影響肌肉細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　1.喹賽多作用于C2C12肌管的最佳濃度與時(shí)間的選取
　　本研究設(shè)置了喹賽多作用濃度梯度（1，2，4，8，12μM

3、），通過(guò)BCA蛋白定量法分別測(cè)定了喹賽多作用C2C12肌管4h，8h，12h后的細(xì)胞總蛋白濃度。結(jié)果表明，2μM喹賽多處理細(xì)胞4h時(shí)細(xì)胞總蛋白含量相對(duì)空白對(duì)照組上調(diào)20％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，差異極顯著。這說(shuō)明2μM、4h的藥物作用濃度與時(shí)間為最佳組合，故以此條件進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的篩選。
　　由于基因表達(dá)模式與蛋白質(zhì)表達(dá)模式的時(shí)空關(guān)系不同，本研究又選取了基因指標(biāo)來(lái)篩選喹賽多對(duì)細(xì)胞基因mRNA水平表達(dá)影響最為合適的作用濃度和時(shí)間。結(jié)合蛋

4、白質(zhì)定量結(jié)果，在五個(gè)梯度濃度中，8μM和12μM濃度喹賽多對(duì)C2C12細(xì)胞無(wú)促進(jìn)作用，而細(xì)胞對(duì)1μM和4μM的藥物作用濃度并不敏感，所以本研究直接采用2μM的藥物濃度作用細(xì)胞，通過(guò)RT-qPCR技術(shù)，分別測(cè)定1h，2h，4h，6h時(shí)細(xì)胞內(nèi)MyHC的mRNA表達(dá)量。結(jié)果表明4h時(shí)MyHC表達(dá)量最高，是空白組的2.4倍。故以此條件進(jìn)行基因芯片分析，以實(shí)現(xiàn)對(duì)差異基因的檢測(cè)。
　　2.喹賽多作用C2C12肌管后差異表達(dá)的基因
　　以

5、2μM濃度的喹賽多孵育細(xì)胞4h，用基因芯片檢測(cè)此時(shí)細(xì)胞基因組中相對(duì)于空白對(duì)照組mRNA表達(dá)量發(fā)生變化的基因。本研究共篩選出68個(gè)已知基因，其中32個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，36個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。對(duì)這些基因進(jìn)行分析，按分子功能可將這些基因分為5類(lèi):結(jié)構(gòu)組分、結(jié)合活性、酶活性、受體活性、轉(zhuǎn)錄活性;按生物進(jìn)程可分為7類(lèi):蛋白質(zhì)修飾、代謝、生物合成、調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激、細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)C2C12肌管的生長(zhǎng)相關(guān)基因進(jìn)行分析，本研究推斷，喹賽多影響肌肉細(xì)胞生長(zhǎng)的可能

6、機(jī)制為:一方面誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Tceal7基因表達(dá)量上調(diào)，引發(fā)細(xì)胞進(jìn)一步融合;一方面通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化水平調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)其促生長(zhǎng)作用。此外，喹賽多還可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動(dòng)，影響代謝相關(guān)基因差異表達(dá)，為細(xì)胞提供物質(zhì)與能量。用RT-qPCR驗(yàn)證部分差異基因表達(dá)，各基因mRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致，證實(shí)本研究所得結(jié)果可靠。
　　3.喹賽多作用C2C12肌管后差異表達(dá)的蛋白
　　2μM濃度的喹賽多作用細(xì)胞

7、4h后，經(jīng)二維凝膠電泳和飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，喹賽多處理組與空白對(duì)照組相比，有20個(gè)差異表達(dá)的蛋白鑒定成功，其中有18個(gè)表達(dá)量上調(diào)，2個(gè)下調(diào)表達(dá)。對(duì)這些蛋白的功能進(jìn)行分析，差異蛋白在分子功能方面主要具備結(jié)合活性和酶活性，對(duì)其所參與的生物進(jìn)程進(jìn)行歸類(lèi):物質(zhì)與能量代謝、生物合成、細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激。烯醇化酶Eno1在喹賽多作用下的C2C12肌管中上調(diào)表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)骨架相關(guān)蛋白和肌肉分化相關(guān)蛋白均出現(xiàn)上調(diào)，預(yù)示喹賽多可能促發(fā)C2

8、C12肌管重塑，進(jìn)一步融合形成更為粗大的肌纖維。
　　在喹賽多作用下，細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶Sod1和過(guò)氧化物酶Prdx1含量增加，多種氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白上調(diào)表達(dá)，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)應(yīng)對(duì)氧化物刺激產(chǎn)生的不良影響。Sod1可將細(xì)胞內(nèi)的自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，Prdx1可進(jìn)一步清除H2O2，使細(xì)胞免受損傷。這提示喹賽多在代謝過(guò)程中可能產(chǎn)生了自由基，進(jìn)而形成H2O2。研究表明，低濃度的H2O2對(duì)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt及其它促