喹賽多對C2C12肌管基因與蛋白表達的影響研究.pdf

1、喹賽多作為新型喹噁啉類抗菌促生長飼料添加藥物，與同類藥物相比，具有更高的安全性。喹賽多對多種家畜家禽及水產(chǎn)動物均有較好的促生長作用。本實驗室前期研究表明，喹賽多可提高豬體內(nèi)循環(huán)GH和IGF-1的含量，能夠誘導(dǎo)豬肝細胞IGF-1的表達量上調(diào)。GH和IGF-1位于動物激素生長軸中，可直接或間接的作用于肌肉組織，使動物整體表現(xiàn)出生長。那么喹賽多是否也能夠直接調(diào)控直觀體現(xiàn)動物生長的肌肉組織呢？探明喹賽多對肌肉組織有無直接作用，若有作用又是通過何

2、種機制發(fā)揮作用，這為進一步探討喹賽多促生長機制提供了理論依據(jù)和新思路。本研究以小鼠成肌細胞C2C12細胞系分化所形成的肌管為研究模型，首先選取了喹賽多作用細胞的最佳濃度和時間，然后通過基因芯片技術(shù)和雙向電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)篩選出了喹賽多影響下差異表達的基因和蛋白質(zhì)，并對喹賽多影響肌肉細胞的機制進行了初步探討。
　　1.喹賽多作用于C2C12肌管的最佳濃度與時間的選取
　　本研究設(shè)置了喹賽多作用濃度梯度（1，2，4，8，12μM

3、），通過BCA蛋白定量法分別測定了喹賽多作用C2C12肌管4h，8h，12h后的細胞總蛋白濃度。結(jié)果表明，2μM喹賽多處理細胞4h時細胞總蛋白含量相對空白對照組上調(diào)20％，統(tǒng)計學(xué)分析表明，差異極顯著。這說明2μM、4h的藥物作用濃度與時間為最佳組合，故以此條件進行差異表達蛋白的篩選。
　　由于基因表達模式與蛋白質(zhì)表達模式的時空關(guān)系不同，本研究又選取了基因指標來篩選喹賽多對細胞基因mRNA水平表達影響最為合適的作用濃度和時間。結(jié)合蛋

4、白質(zhì)定量結(jié)果，在五個梯度濃度中，8μM和12μM濃度喹賽多對C2C12細胞無促進作用，而細胞對1μM和4μM的藥物作用濃度并不敏感，所以本研究直接采用2μM的藥物濃度作用細胞，通過RT-qPCR技術(shù)，分別測定1h，2h，4h，6h時細胞內(nèi)MyHC的mRNA表達量。結(jié)果表明4h時MyHC表達量最高，是空白組的2.4倍。故以此條件進行基因芯片分析，以實現(xiàn)對差異基因的檢測。
　　2.喹賽多作用C2C12肌管后差異表達的基因
　　以

5、2μM濃度的喹賽多孵育細胞4h，用基因芯片檢測此時細胞基因組中相對于空白對照組mRNA表達量發(fā)生變化的基因。本研究共篩選出68個已知基因，其中32個基因上調(diào)表達，36個基因下調(diào)表達。對這些基因進行分析，按分子功能可將這些基因分為5類:結(jié)構(gòu)組分、結(jié)合活性、酶活性、受體活性、轉(zhuǎn)錄活性;按生物進程可分為7類:蛋白質(zhì)修飾、代謝、生物合成、調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激、細胞生長。對C2C12肌管的生長相關(guān)基因進行分析，本研究推斷，喹賽多影響肌肉細胞生長的可能

6、機制為:一方面誘導(dǎo)細胞內(nèi)Tceal7基因表達量上調(diào)，引發(fā)細胞進一步融合;一方面通過影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化水平調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號通路實現(xiàn)其促生長作用。此外，喹賽多還可增強細胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動，影響代謝相關(guān)基因差異表達，為細胞提供物質(zhì)與能量。用RT-qPCR驗證部分差異基因表達，各基因mRNA表達量變化趨勢與芯片結(jié)果一致，證實本研究所得結(jié)果可靠。
　　3.喹賽多作用C2C12肌管后差異表達的蛋白
　　2μM濃度的喹賽多作用細胞

7、4h后，經(jīng)二維凝膠電泳和飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，檢測發(fā)現(xiàn)，喹賽多處理組與空白對照組相比，有20個差異表達的蛋白鑒定成功，其中有18個表達量上調(diào)，2個下調(diào)表達。對這些蛋白的功能進行分析，差異蛋白在分子功能方面主要具備結(jié)合活性和酶活性，對其所參與的生物進程進行歸類:物質(zhì)與能量代謝、生物合成、細胞分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化應(yīng)激。烯醇化酶Eno1在喹賽多作用下的C2C12肌管中上調(diào)表達，細胞內(nèi)骨架相關(guān)蛋白和肌肉分化相關(guān)蛋白均出現(xiàn)上調(diào)，預(yù)示喹賽多可能促發(fā)C2

8、C12肌管重塑，進一步融合形成更為粗大的肌纖維。
　　在喹賽多作用下，細胞內(nèi)超氧化物歧化酶Sod1和過氧化物酶Prdx1含量增加，多種氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白上調(diào)表達，通過激活細胞內(nèi)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)來應(yīng)對氧化物刺激產(chǎn)生的不良影響。Sod1可將細胞內(nèi)的自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，Prdx1可進一步清除H2O2，使細胞免受損傷。這提示喹賽多在代謝過程中可能產(chǎn)生了自由基，進而形成H2O2。研究表明，低濃度的H2O2對骨骼肌細胞內(nèi)的PI3K/Akt及其它促