周期性應(yīng)力加載對(duì)C2C12細(xì)胞自身抗原及TLR3表達(dá)的影響.pdf

1、特發(fā)性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathies，IIMs)是一組異質(zhì)性的骨骼肌自身免疫性疾病，臨床上以進(jìn)行性肌無(wú)力伴骨骼肌炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為特征。根據(jù)不同的臨床及組織病理形態(tài)學(xué)特征，炎性肌病可分為多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)、皮肌炎(dermatomyositis，DM)和包涵體肌炎(inclusion-body myositis，IBM)[1]。廣泛出現(xiàn)的毛細(xì)血管周?chē)?DM)、肌束膜和

2、肌內(nèi)膜(PM，IBM)的多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)是炎性肌病的特征性病理改變。肌組織內(nèi)滲出的巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞，中性粒細(xì)胞等釋放多種化學(xué)因子和趨化因子，或協(xié)同炎性肌纖維（表達(dá)MHC-Ⅰ）發(fā)揮抗原呈遞(APCs)作用，動(dòng)員炎性肌組織內(nèi)T細(xì)胞的滲出和/或原位克隆，通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶等細(xì)胞毒性因子，殺傷與之接觸的、或遠(yuǎn)距離的肌纖維，引發(fā)持續(xù)而反復(fù)的肌纖維壞死和無(wú)效的成肌再生[2-4]。自身免疫性肌炎患者的臨床特征性表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌無(wú)力、肌纖維化

3、和肌萎縮（以近端肌肉更為嚴(yán)重）。患者最終因肌纖維的喪失和肌組織的纖維化，出現(xiàn)骨骼肌收縮能力的完全喪失。磁共振波譜檢測(cè)證實(shí)，由于毛細(xì)血管減少，肌細(xì)胞線粒體功能障礙，炎性肌細(xì)胞出現(xiàn)三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸(PCr)含量下降，導(dǎo)致肌纖維能量代謝障礙、肌無(wú)力持續(xù)加重，以及成肌再生不良[5]。目前治療IIMs主要以皮質(zhì)類(lèi)固醇聯(lián)合免疫抑制劑為主，雖然部分患者經(jīng)藥物治療后肌肉性能得到改善，但僅能恢復(fù)肌肉部分功能[6];多數(shù)患者經(jīng)長(zhǎng)療程治療后仍殘

4、留功能受限和生活質(zhì)量低下，而長(zhǎng)期高劑量使用皮質(zhì)類(lèi)固醇和免疫抑制劑會(huì)導(dǎo)致慢性骨和肌肉代謝損傷[7]。
　　 近年的研究證實(shí)，運(yùn)動(dòng)和拉伸訓(xùn)練能改善IIMs患者肌肉收縮強(qiáng)度，減少肌肉損傷，改善肌肉性能[8-10]。此外，力學(xué)刺激是維持細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的重要細(xì)胞外刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝和基因表達(dá)過(guò)程，在成肌細(xì)胞激活、增殖與分化中起著重要作用[11]。國(guó)內(nèi)外已有大量研究證實(shí)力學(xué)刺激能促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)已被證實(shí)是唯一

5、一種能激活體內(nèi)或體外培養(yǎng)的靜止期成肌細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的生長(zhǎng)因子[12]。通過(guò)檢測(cè)DNA摻合溴脫氧尿核苷的方式，Tatsumi R[13]的研究組發(fā)現(xiàn):力學(xué)刺激體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞2小時(shí)，可導(dǎo)致HGF活化;進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)力學(xué)刺激促進(jìn)一氧化氮合成酶(NOS)激活，誘導(dǎo)HGF釋放，導(dǎo)致成肌細(xì)胞活化增殖[14]。Tatsumi R因此總結(jié)出力學(xué)刺激導(dǎo)致成肌細(xì)胞增殖的力學(xué)信號(hào)通道:Calcium-Calmodulin復(fù)合物形成、NOS和金屬蛋白酶

6、(MMPs)激活、HGF釋放并結(jié)合C-met受體，從而促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖[15]。
　　 生理?xiàng)l件下，骨骼肌組織表達(dá)極微量的肌炎自身抗原，而炎性肌組織中反復(fù)再生的不成熟肌纖維則持續(xù)高表達(dá)特異性的肌炎自身抗原，如histidyl tRNAsynthetase(HRS/Jo-1)，Mi-2(DM患者)，U1-70，以及Ku/the catalyticsubunit of DNA-dependent protein kinase(DNA

7、-PKcs)，體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞表達(dá)高水平的自身抗原，但隨著成肌細(xì)胞分化融合并形成肌管，自身抗原逐漸下調(diào)，這表明在自身免疫性肌病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，自身抗原主要由再生的肌纖維合成和表達(dá)，炎性過(guò)程的啟動(dòng)和發(fā)展并不涉及成熟的肌管[16，17]。炎性肌病的發(fā)展過(guò)程中，表達(dá)自身抗原的再生肌纖維成為細(xì)胞毒性攻擊的目標(biāo)，反復(fù)發(fā)生的肌纖維壞死和成肌再生分化導(dǎo)致自身抗原的持續(xù)產(chǎn)生，從而引發(fā)肌炎的病理過(guò)程和免疫反應(yīng)的持續(xù)性和不可修復(fù)性。此外，作為Ⅰ型跨膜蛋

8、白，Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)成員在先天性免疫反應(yīng)，尤其是調(diào)節(jié)吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞等）特異性識(shí)別微生物病原體抗原，分泌促炎細(xì)胞因子，上調(diào)共刺激分子并誘導(dǎo)機(jī)體獲得性免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，被稱(chēng)為先天性和獲得性免疫調(diào)節(jié)中的輔助受體.近期的研究(Tournadre A，2010)[18]發(fā)現(xiàn)，自身免疫性肌炎患者的骨骼肌組織呈現(xiàn)TLR3和TLR7的陽(yáng)性表達(dá)，尤其高表達(dá)于成肌細(xì)胞，并經(jīng)由TLR信

9、號(hào)通路，促使Th1和Th17相關(guān)細(xì)胞因子分泌釋放，加速肌纖維的壞死和收縮功能的喪失。
　　 炎性肌病以肌組織的壞死、肌萎縮和收縮力減弱或喪失為特征，那么，肌炎自身抗原、TLRs在增殖的成肌細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)的特性與成肌細(xì)胞的力學(xué)信號(hào)之間是否存在相關(guān)性，力學(xué)信號(hào)是否直接指導(dǎo)并參與肌炎自身抗原的啟動(dòng)以及Toll受體的表達(dá)？力學(xué)信號(hào)的減弱或消失是否促進(jìn)或降低自身抗原和Toll受體的表達(dá)，從而加速肌纖維的壞死并影響炎性肌病的發(fā)生和歸宿？本

10、實(shí)驗(yàn)對(duì)體外培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞進(jìn)行周期性的促增殖應(yīng)力加載刺激，檢測(cè)力學(xué)加載前后成肌細(xì)胞自身抗原和TLRs的表達(dá)，判斷力學(xué)信號(hào)是否促進(jìn)或抑制成肌細(xì)胞自身抗原和TLRs的表達(dá)和釋放。在此基礎(chǔ)上，采用不同的拮抗劑或促進(jìn)劑干擾成肌增殖特定的力學(xué)信號(hào)分子，進(jìn)一步分析成肌細(xì)胞內(nèi)特定力學(xué)增殖信號(hào)分子（Calcium，Calmodulin，NOS，MMPs，HGF，C-met）對(duì)自身抗原和TLRs表達(dá)可能的干擾作用，從而揭示骨骼肌收縮能力與肌炎自身抗原

11、、TLRs的相關(guān)性。
　　 主要研究?jī)?nèi)容
　　 第一章篩選促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖的應(yīng)力加載條件
　　 [目的]
　　 周期性應(yīng)力加載的力學(xué)條件通過(guò)Flexercell5000加載系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C2C12細(xì)胞周期，篩選促C2C12細(xì)胞增殖的力學(xué)刺激條件。
　　 [方法]
　　 C2C12細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后用含100 mg/L的青霉素、100 mg/L的鏈霉素和10％胎牛血清的DME

12、M/F12完全培養(yǎng)基，37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C2C12細(xì)胞按1×105/mL密度接種于包被Ⅰ型膠原的Bioflex6孔培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)24小時(shí)后，以0.25Hz頻率、10％拉伸幅度進(jìn)行2天、4天和6天周期性拉伸;細(xì)胞培養(yǎng)分組:①2天對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)。②2天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進(jìn)行每天2小時(shí)力學(xué)加載，連續(xù)加載2天。③4天對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)，2天后常規(guī)更換培養(yǎng)基。④4天拉伸組:置于F

13、lexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進(jìn)行每天2小時(shí)力學(xué)加載，連續(xù)加載4天。⑤6天對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)，第2天和4天后常規(guī)更換培養(yǎng)基。⑥6天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進(jìn)行每天2小時(shí)力學(xué)加載，連續(xù)加載6天。另外，以1Hz頻率、15％拉伸幅度拉伸1小時(shí)，23小時(shí)后收集細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察C2C12細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)情況和細(xì)胞脫落情況。分別在相應(yīng)天數(shù)收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞周期檢測(cè)。流式結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±

14、s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent-Samples TTest），P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 C2C12細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，接種后4小時(shí)大部分已貼壁，呈橢圓形或不規(guī)則形，12小時(shí)后完全伸展呈梭形及多角形，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多;采用0.25Hz頻率、10％拉伸幅度的拉伸加載條件:2天時(shí)，拉伸組C2C12細(xì)胞的增殖情況較對(duì)照組明顯;4天時(shí)，對(duì)照組和拉伸組可見(jiàn)C2C12細(xì)胞出現(xiàn)分化

15、，而6天時(shí)，兩組均可見(jiàn)細(xì)胞部分融合。采用1Hz頻率、15％拉伸幅度的拉伸加載條件:拉伸組的細(xì)胞脫落明顯。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)每組3個(gè)樣本細(xì)胞的分裂增殖周期，C2C12細(xì)胞的增殖情況用DNA增殖指數(shù)表達(dá):
　　 [DPI％=(S％+G2/M％)/(S％+G2/M％+G0/G1％)]，2天時(shí)，拉伸組DPI％為(37.00±1.43)％，較對(duì)照組(21.09±2.72)％明顯增高(P=0.001，

16、n=3);4天時(shí)，拉伸組DPI％為(13.89±0.99)％較對(duì)照組(11.64±0.80)％增高(P=0.038，n=3)。采用1Hz頻率、15％拉伸幅度的拉伸加載條件:拉伸組凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著上升。
　　 [結(jié)論]
　　 采用0.25Hz頻率，10％拉伸幅度的加載條件進(jìn)行周期性力學(xué)刺激可以明顯促進(jìn)C2C12細(xì)胞增殖，隨著細(xì)胞數(shù)量增多及分化融合，促增殖效應(yīng)逐漸下降。高頻率，大于15％的拉伸幅度的應(yīng)力加載條件會(huì)干擾細(xì)胞活性

17、，加速C2C12細(xì)胞凋亡。
　　 第二章周期性促增殖應(yīng)力加載干擾C2C12細(xì)胞自身抗原和TLRs表達(dá)
　　 [目的]
　　 采用0.25Hz頻率、10％拉伸幅度的促增殖力學(xué)刺激條件，進(jìn)行2天和4天的周期性力學(xué)刺激，通過(guò)qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)C2C12細(xì)胞自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLRs(TLR3和TLR7)基因及蛋白的表達(dá)，采用Western blot技術(shù)檢

18、測(cè)力學(xué)信號(hào)分子(Calmodulin、NOS、MMP2、HGF、C-met)蛋白的表達(dá)。
　　 [方法]
　　 C2C12細(xì)胞按1×105/mL密度接種于包被Ⅰ型膠原的Bioflex6孔培養(yǎng)板上貼壁培養(yǎng)24小時(shí)，以0.25Hz頻率、10％拉伸幅度進(jìn)行2天、4天周期性拉伸;細(xì)胞培養(yǎng)分組:①2天對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)。②2天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進(jìn)行每天2小時(shí)力學(xué)加載，連續(xù)加載2天。③4天對(duì)照組:

19、常規(guī)培養(yǎng)，2天后常規(guī)更換培養(yǎng)基。④4天拉伸組:置于Flexercell5000柔性基底加載系統(tǒng)進(jìn)行每天2小時(shí)力學(xué)加載，連續(xù)加載4天。在相應(yīng)天數(shù)收集細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，Ol igo(dT)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，經(jīng)特定引物PCR擴(kuò)增;用凱基全蛋白試劑盒提取總蛋白，用SDS/PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，孵育一抗二抗后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way

20、ANOVA)，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]以0.25Hz頻率、10％拉伸幅度為拉伸加載條件，用qPCR和western blot檢測(cè)C2C12細(xì)胞自身抗原和TLRs的表達(dá)情況:2天時(shí)，拉伸組的自身抗原(Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70)和TLR3相對(duì)基因和蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組明顯降低（P＜0.001，n=3）;4天時(shí)，對(duì)照組與拉伸組沒(méi)有明顯差異

21、。與2天對(duì)照組相比，4天對(duì)照組的自身抗原和TLR3表達(dá)降低（P＜0.05，n=3)。然而在體外培養(yǎng)的C2C12細(xì)胞中，拉伸組和對(duì)照組都沒(méi)有檢測(cè)到TLR7 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。2天時(shí)，拉伸組的力學(xué)信號(hào)分子（Calmodulin、NOS、MMP2、HGF、C-met）相對(duì)蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組明顯增高（P＜0.001，n=3），4天時(shí)，拉伸組僅有NOS相對(duì)蛋白水平表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05，n=3）;而4天對(duì)照組與2天對(duì)照組比較，MM

22、P2、HGF和C-met表達(dá)降低（P＜0.01，n=3)。
　　 [結(jié)論]
　　 短期的力學(xué)刺激可以抑制自身抗原和TLR3表達(dá)，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞分化融合以及對(duì)力學(xué)刺激的適應(yīng)，力學(xué)刺激對(duì)自身抗原表達(dá)抑制作用減弱。而力學(xué)信號(hào)分子在2天時(shí)表達(dá)水平較高，隨著刺激天數(shù)增加、細(xì)胞分化融合以及對(duì)力學(xué)刺激的適應(yīng)，力學(xué)信號(hào)分子表達(dá)下降。因此，在短期力學(xué)刺激對(duì)自身抗原和TLR3的表達(dá)抑制作用中，力學(xué)信號(hào)分子可能起著關(guān)鍵作用。
　　

23、 第三章力學(xué)信號(hào)分子干擾體外培養(yǎng)C2C12細(xì)胞自身抗原及TLR3的表達(dá)
　　 [目的]
　　 在培養(yǎng)基中添加特定的力學(xué)信號(hào)分子的促進(jìn)劑或拮抗劑，通過(guò)qPCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)C2C12細(xì)胞自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）和Toll樣受體TLR3基因及蛋白的表達(dá)。
　　 [方法]
　　 當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80％左右時(shí)，用PBS清洗2次后，分別加入含有鈣離子載體A2318

24、7(3μmol/L)、鈣離子螯合劑EGTA（1.8mmol/L）、調(diào)鈣蛋白Calmodulin(1μg/ml)、調(diào)鈣蛋白抑制劑Calmidazolium Chloride(0.3μmol/L)、NOS促進(jìn)劑SNP(30μmol/L)、NOS抑制劑L-NAME(10μmol/L)、MMP-2(10 ng/ml)、MMP-2抑制劑1(250 ng/ml)、重組HGF(20 ng/ml)、anti-HGF兔多抗(2μg/ml)、重組C-met

25、(1μg/ml)、anti-C-met兔多抗(2μg/ml)的DMEM，置于37℃、體積百分比為5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后收集細(xì)胞。用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用Oligo(dT)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，經(jīng)特定引物PCR擴(kuò)增;用凱基全蛋白試劑盒提取總蛋白，用SDS/PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，孵育一抗二抗后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOV

26、A)，若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [結(jié)果]
　　 采用qPCR和Westem blot技術(shù)對(duì)所獲取的C2C12細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè):A23187組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）和TLR3的相對(duì)基因及蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組降低（P＜0.001，n=3)，EGTA組則相反;Calmodulin組的自身抗原（HRS和DNA-PKcs）和TLR

27、3相對(duì)基因及蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組降低(P＜0.05，n=3)，Calmidazolium Chloride組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）較對(duì)照組升高（P＜0.05，n=3）。SNP組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-70）和TLR3的相對(duì)基因及蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組降低（P＜0.001，n=3），L-NAME組則相反。MMP-2組的自身抗原（Mi-2、HRS、DNA-PKcs和U1-

28、70）和TLR3的相對(duì)基因及蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，MMP-2抑制劑1組的較對(duì)照組降低（P＜0.05，n=3)。重組HGF組的自身抗原（HRS、DNA-PKcs和U1-70）和TLR3的相對(duì)基因及蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組降低（P＜0.05，n=3），anti-HGF兔多抗組的自身抗原（Mi-2、HRS和DNA-PKcs）和TLR3較對(duì)照組升高(P＜0.05，n=3)。重組C-met組的自身抗原（Mi-2、HRS和U1-70）的

29、相對(duì)基因及蛋白水平的表達(dá)較對(duì)照組降低（P＜0.05，n=3)，anti-C-met兔多抗組的自身抗原(Mi-2、HRS和U1-70)和TLR3較對(duì)照組升高(P＜0.05，n=3)。
　　 [結(jié)論]
　　 上調(diào)C2C12細(xì)胞內(nèi)Calmodulin和NOS能明顯抑制自身抗原和TLR3的基因及蛋白表達(dá)。MMP-2的細(xì)胞內(nèi)高濃度對(duì)自身抗原和TLR3的相對(duì)基因及蛋白水平的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，但MMP-2抑制劑1顯著抑制自身抗原表達(dá)。