HCV NS5A對TLR3、TLR4表達的影響.pdf

1、目的：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染呈全球性流行發(fā)展,是歐美及日本等國家終末期肝臟疾病的主要原因之一。目前,全球HCV的感染率約為3％,大約1.7億人感染HCV,每年新發(fā)丙型肝炎病例達到3.5萬例。我國HCV感染率為1.5～3.5％,總體感染人群3000萬以上。HCV感染后約80％成為慢性持續(xù)狀態(tài),慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化,甚至可發(fā)展為肝硬化及肝細胞癌,對患者的健康和生命危害非常大,已成為嚴

2、重的社會和公共衛(wèi)生問題。丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A作為重要的非結(jié)構(gòu)蛋白,近年來有關(guān)它的研究倍受關(guān)注,它具有抗凋亡、轉(zhuǎn)錄激活作用、干擾細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、調(diào)解病毒復(fù)制水平等多項生物學活性,提示其在干擾素療效預(yù)測、病毒復(fù)制、細胞凋亡、肝細胞癌發(fā)生等多方面均具有重要作用。目前關(guān)于TLRs與機體相互作用的機制成為研究熱點之一,其中Toll樣受體3(TLR3)主要表達于樹突狀細胞,能夠識別病毒的dsRNA,在抗病毒過程中發(fā)揮了重要作用。TLR

3、4是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動物TLRs蛋白,機體多種細胞表面均能表達TLR4,它被認為與革蘭氏陰性細菌及其內(nèi)毒素的識別和激活有關(guān)。它們在肝臟疾病包括酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化等的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
　　 在本研究中,我們通過轉(zhuǎn)染HCV NS5A蛋白表達質(zhì)粒觀察HCV NS5A蛋白對肝細胞內(nèi)TLR3及TLR4 mRNA和蛋白表達的影響,為丙型肝炎的發(fā)病機制積累實驗依據(jù),并對丙型肝炎的治療提供理論依據(jù)。
　　 方法

4、：1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將QSG7701細胞種植于六孔板,待細胞融合60-70％時,按照說明書中的轉(zhuǎn)染程序,分別將pcNS5A和pRc/CMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞,12小時后換含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞進行接下來的實驗。
　　 2.免疫細胞化學染色:用免疫細胞化學染色的方法檢測TLR4蛋白質(zhì)及NSSA蛋白質(zhì)的表達。
　　 3.RT-PCR:按RNA提取試劑盒說明書進行,提取上述轉(zhuǎn)染的7701細胞總RNA,

5、用紫外光分光光度計測定RNA的濃度。取2ugRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行PCR擴增,再用2％瓊脂糖凝膠電泳觀測TLR3 mRNA及TLR4 mRNA結(jié)果并照相。
　　 4.間接免疫熒光:用間接免疫熒光的方法檢測TLR3及TLR4蛋白質(zhì)的表達。
　　 5.Western blot:用Western blot的方法以β-actin為參照,檢測TLR4蛋白質(zhì)的表達。
　　 結(jié)果：1.轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組的7701細胞

6、內(nèi)有HCV NS5A蛋白顆粒表達,呈棕黃色顆粒,主要分布在細胞漿中,以胞核周圍最為明顯,未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組的7701細胞中則無HCVNS5A蛋白表達。
　　 2.用免疫細胞化學染色檢測TLR4蛋白的表達,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組內(nèi)有TLR4蛋白質(zhì)表達,呈棕黃色顆粒,分布在細胞膜中,未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組則無明顯TLR4蛋白表達。說明HCVNS5A能夠促進TLR4蛋白質(zhì)的表達。
　　 3.

7、用RT-PCR檢測TLR3及TLR4 mRNA的表達。結(jié)果表明,在GAPDH內(nèi)參照表達一致情況下,pcNS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組TLR4 mRNA的表達量明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組,空載體組和未轉(zhuǎn)染組mRNA的表達相似,結(jié)果說明HCV NS5A能夠激活TLR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;然而,pcNS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空載體組和未轉(zhuǎn)染組TLR3 mRNA的表達量無明顯差別,說明HCV NS5A對TLR3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平至少無上調(diào)作用。
　　

8、4.用免疫熒光方法檢測TLR3及TLR4蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組內(nèi)有TLR4蛋白質(zhì)表達,呈現(xiàn)綠色熒光顆粒,未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組則無明顯TLR4蛋白表達。說明HCV NS5A能夠促進TLR4蛋白質(zhì)的表達。轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組內(nèi)及未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組的細胞內(nèi)均無TLR3蛋白顆粒的表達,說明HCV NS5A對TLR3蛋白的表達無上調(diào)作用。
　　 5.用Western blot檢測TUR

9、4蛋白質(zhì)的表達,以β-actin為內(nèi)參照。結(jié)果顯示pcNS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組TLR4蛋白質(zhì)的表達量明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組,空載體組和未轉(zhuǎn)染組的表達相似。說明HCV NS5A能夠促進TLR4蛋白質(zhì)的表達。
　　 結(jié)論：1.HCV NS5A表達質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染至QSG7701細胞中,表達HCV NS5A蛋白。
　　 2.HCV NS5A能激活TLR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 3.HCV NS5A能促進TLR4蛋白質(zhì)的