胰島素誘導C2C12細胞增殖和凋亡的機制研究.pdf

1、目的
　　胰島素是一類在人類胰腺中發(fā)現(xiàn)的分泌肽激素，它能提高葡萄糖的利用率。已有研究發(fā)現(xiàn)胰島素能誘導C2C12細胞（小鼠成肌細胞，即肌前體細胞）增殖和肌細胞生成。胰島素如何誘導C2C12細胞增殖的作用機制尚不明確。GATA-6是具有鋅指結構的轉錄因子。GATA-6在心肌細胞分化和保持血管平滑肌細胞分化表型中發(fā)揮重要作用。過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)在脂類代謝如脂肪酸轉運和β-氧化中起著重要調(diào)節(jié)作用。GATA-6和PP

2、ARα是否參與胰島素對細胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)將是一項很有趣的研究。細胞凋亡受BCL-2家族蛋白（B-細胞淋巴瘤-2）的調(diào)節(jié)，BAD（細胞凋亡BCL-2促凋亡蛋白）是BCL-2家族成員之一，能夠誘導細胞凋亡。CyclinD1是D型細胞周期蛋白的一種。能與CDK4和CDK6作用激活細胞進入細胞周期。但是有關cyclinD1和BAD在胰島素處理的C2C12細胞中的表達卻知之甚少。
　　方法
　　本研究中我們用MTT法、流式細胞分析、

3、細胞凋亡定量、DAPI染色、熒光素酶報告基因實驗、QuantitativeReal-TimePCR及WesternBlot實驗來研究胰島素對C2C12細胞增殖、凋亡和細胞周期的作用。
　　結果
　　MTT實驗結果表明10nM的胰島素處理C2C12細胞促進細胞增殖(P＜0.01)，而50nM和100nM的胰島素處理則誘導C2C12細胞凋亡。與對照細胞相比，過表達GATA-6能促進C2C12細胞生長(P＜0.01)，這種促進作用

4、在給予10nM胰島素處理后得到增強而50nM和100nM胰島素處理后該促進作用被逆轉。過表達GATA-6和PPARα雖然誘導細胞增殖但不能逆轉50nM和100nM胰島素誘導產(chǎn)生的細胞凋亡。
　　流式細胞分析表明10nM胰島素促進細胞周期進程，50nM和100nM胰島素則將細胞周期阻滯在S期。過表達PPARα/GATA-6促進細胞周期進程，在10nM胰島素處理時該促進作用增強，而50nM和100nM胰島素處理時則逆轉該作用誘導細胞周

5、期阻滯。且PPARα和GATA-6均不能緩解50nM和100nM胰島素產(chǎn)生的該阻滯作用。
　　DAPI染色結果顯示與對照細胞相比50nM和100nM胰島素處理的細胞表現(xiàn)出較高水平的染色質固縮，而10nM胰島素處理的細胞染色均勻未表現(xiàn)出細胞凋亡后染色質固縮。PPARα和GATA-6均不能逆轉50nM和100nM胰島素誘導的細胞凋亡染色質固縮。
　　熒光素酶報告基因瞬時轉染實驗表明不同濃度胰島素分別誘導cyclinD1和BAD的

6、轉錄。10nM胰島素激活cyclinD1啟動子活性，抑制BAD啟動子的活性，促進細胞增殖。而50/100nM胰島素則激活BAD的啟動子，抑制cyclinD1啟動子活性，誘導細胞凋亡。GATA-6和PPARα均能增強cyclinD1啟動子活性，逆轉50nM胰島素誘導的cyclinD1啟動子活性的降低，卻不能逆轉100nM胰島素產(chǎn)生的作用。而且，GATA-6和PPARα均能抑制50nM和100nM胰島素誘導的激活BAD啟動子活性的作用。

7、r>　　QuatitiveRealTime-PCR和WesternBlot分析發(fā)現(xiàn)10nM和50/100nM胰島素處理細胞分別誘導cyclinD1和BAD的表達。10nM胰島素處理誘導cyclinD1的表達(P＜0.01)，50/100nM胰島素處理則抑制cyclinD1的表達(P＜0.01)，促進BAD的表達。在過表達GATA-6或PPARα的C2C12細胞中也得到了相同的實驗結果。雖然過表達GATA-6的細胞中cyclinD1的表達