NF-κB過度激活損害C2C12骨骼肌細胞胰島素敏感性且介導(dǎo)棕櫚酸所致胰島素抵抗.pdf

1、目前已有的研究提示骨骼肌中脂質(zhì)誘導(dǎo)的胰島素抵抗可能與IKKβ/IκBα/NF-κB途徑激活相關(guān)。體內(nèi)外均有研究發(fā)現(xiàn)阻斷該通路可避免或改善FFA對肌細胞胰島素作用的不利影響，因而有觀點認為該炎癥通路的激活與骨骼肌胰島素抵抗存有因果關(guān)系。然而此觀點也遭到了質(zhì)疑，Polkinghorne在大鼠活體的單肌肉組織中通過電轉(zhuǎn)染攜有目的基因質(zhì)粒的方法高表達p65和IKKβ一周，得出未發(fā)現(xiàn)IKKβ/NF-κB與肌組織胰島素抵抗有明確相關(guān)性的結(jié)論。即便支

2、持兩者有因果關(guān)系的研究者們對NF-κB在該過程中所起的作用也有分歧，支持NF-κB發(fā)揮關(guān)鍵作用的觀點基于在肌細胞中抑制NF-κB的活性可改善多種因素所致的胰島素功能受損；而另一種觀點認為IKKβ是影響胰島素敏感性更重要的分子靶點，理由為IKKβ可誘導(dǎo)胰島素受體底物1(IRS-1)的絲氨酸磷酸化并損害胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 本課題擬探討NF-κB在骨骼肌胰島素抵抗中所起的作用。NF-κB的過度激活是否在脂質(zhì)誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素抵抗中

3、發(fā)揮重要作用?NF-κB過度激活本身能否引起骨骼肌胰島素抵抗?為解答上述問題，本研究采用siRNA技術(shù)特異性的抑制NF-κB p65，觀察NF-κB在棕櫚酸誘導(dǎo)的肌細胞胰島素抵抗中所起的作用；并同樣采用siRNA技術(shù)抑制IκBα，以期過度激活NF-κB，并觀察其對肌細胞胰島素功能的影響。
　　 本研究內(nèi)容分為三個部分
　　 1.以不同濃度梯度的棕櫚酸作用于C2C12骨骼肌細胞，觀察其對NF-κB p65的表達和葡萄糖攝取

4、的影響，以及兩者之間是否存在相關(guān)性。
　　 2.利用siRNA技術(shù)抑制NF-κB p65和IκBα基因在小鼠C2C12骨骼肌細胞中的表達。
　　 3.以棕櫚酸、IκBαsiRNA、棕櫚酸聯(lián)合NF-κB p65 siRNA作為干預(yù)因素處理C2C12細胞，檢測NF-κB活性和胰島素功能相關(guān)指標。
　　 第一部分：不同濃度梯度的棕櫚酸對C2C12骨骼肌細胞葡萄糖攝取及NF-κB活性的影響
　　 研究目的：

5、>　　 以不同濃度梯度的棕櫚酸作用于C2C12骨骼肌細胞，觀察其對NF-κB p65活性和葡萄糖攝取的影響，并觀察兩者之間是否存在相關(guān)性。
　　 研究方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)及干預(yù)
　　 C2C12成肌細胞在含有10％FBS的高糖DMEM增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在約達到80％融合時換成含有2％HS的高糖DMEM分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液一次，約4天后成肌細胞分化成為肌管。分別用不同濃度的棕櫚酸(0，0.25，0.50

6、，0.75和1.0 mM)處理肌管16小時。
　　 2.氚標葡萄糖攝取率檢測
　　 各濃度棕櫚酸處理后的肌管細胞分別行基礎(chǔ)葡萄糖攝取率檢測和胰島素刺激后葡萄糖攝取率檢測。通過液體閃爍計數(shù)儀測定[3H]2-脫氧葡萄糖(2DG)放射活性，并以Bradford法測定樣品蛋白濃度較正2DG攝取率結(jié)果。最后結(jié)果=樣品每分鐘衰變數(shù)/相應(yīng)蛋白濃度(cpm/mg protein)。
　　 3.NF-κB活性檢測
　　 提

7、取各組細胞總蛋白，用Western Blotting方法檢測NF-κB蛋白表達及其磷酸化，并檢測NF-κB抑制蛋白IκBα的表達。β-actin為內(nèi)參照，曝光后的膠片用Quantity One軟件對條帶進行密度掃描分析。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS for Windows16.0統(tǒng)計軟件包進行分析處理。實驗數(shù)據(jù)首先進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布或經(jīng)轉(zhuǎn)換后呈正態(tài)分布者用均數(shù)±標準差(means±SD)形式表示

8、，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方查齊性則組間比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用Student's t檢驗，p＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.使用不同濃度棕櫚酸(0、0.25、0.50、0.75、1.00 mM)作用于C2C12骨骼肌細胞，當(dāng)棕櫚酸濃度超過0.50mM時，可觀察到胰島素刺激后2DG攝取量減少、IκBα蛋白表達減少及NF-κB活性增強，且胰島素刺激后2

9、DG攝取量的減少與NF-κB活性的增強之間有相關(guān)性。提示棕櫚酸刺激細胞后至少部分通過降解IκBα激活NF-κB，且NF-κB的激活可能參與了棕櫚酸所致的骨骼肌細胞胰島素抵抗。
　　 2.棕櫚酸濃度在0.75mM可達到較好的胰島素刺激后的2-DG攝取率抑制效果，因而采用該濃度進一步研究NF-κB在胰島素抵抗中所起的作用。
　　 第二部分：siRNA抑制C2C12骨骼肌細胞NF-κB p65和IκBα基因表達
　　

10、研究目的：
　　 使用siRNA技術(shù)抑制C2C12骨骼肌細胞NF-κB p65和IκBα基因的表達
　　 研究方法：
　　 1.siRNA制備
　　 化學(xué)合成3對NF-κB p65 siRNA,3對IκBαsiRNA，1對陰性對照siRNA及1對FAM標記陰性對照siRNA，由GenePharma公司合成。
　　 2.細胞培養(yǎng)
　　 C2C12成肌細胞培養(yǎng)并分化為肌管。
　　 3.

11、siRNA轉(zhuǎn)染
　　 使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按說明書操作。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，選擇最佳siRNA轉(zhuǎn)染濃度和轉(zhuǎn)染比例，在最優(yōu)染條件下分別轉(zhuǎn)染3對NF-κB p65 siRNA、3對IκBαsiRNA及1對陰性對照siRNA。
　　 4.檢測基因抑制效率
　　 在轉(zhuǎn)染后24、48、72h后收集細胞，提取總的RNA和蛋白質(zhì)，分別用RT-PCR和Western Blotting方法檢測目的基因的表達

12、。
　　 5.統(tǒng)計分析
　　 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(means±SD)形式表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及SNK-q檢驗，兩組間比較采用Student'st檢驗，p＜0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：使用RNA干擾(RNAi)技術(shù)分別篩選出有效的NF-κB p65 siRNA和IκBαsiRNA，為進一步研究打下基礎(chǔ)。
　　 第三部分NF-κB對胰島素功能的影響研

13、究
　　 目的：
　　 探討NF-κB在胰島素抵抗中所起的作用。以棕櫚酸作為干預(yù)因素處理C2C12骨骼肌細胞，通過抑制NF-κB p65表達觀察NF-κB是否介導(dǎo)棕櫚酸所致的胰島素抵抗；通過抑制IκBα以期過度激活NF-κB，觀察能否引起胰島素敏感性下降。
　　 研究方法：
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 C2C12成肌細胞培養(yǎng)并分化為肌管。
　　 2.實驗分組
　　 完全分化成熟的肌管

14、細胞分為六組，分別轉(zhuǎn)染p65 siRNA(1組)、IκBαsiRNA(1組)、陰性對照siRNA(2組)及僅加入轉(zhuǎn)染試劑(2組)，24h后部分細胞加入0.75mM棕櫚酸孵育16h。
　　 A組：陰性對照組(轉(zhuǎn)染試劑)
　　 B組：con siRNA對照組(陰性對照siRNA)
　　 C組：棕櫚酸處理組(轉(zhuǎn)染試劑+棕櫚酸)
　　 D組：棕櫚酸+con siRNA處理組(陰性對照siRNA+棕櫚酸)
　

15、　 E組：IκBαsiRNA處理組(IκBαsiRNA)
　　 F組：棕櫚酸+p65 siRNA處理組(p65 siRNA+棕櫚酸)
　　 3.NF-κB活性檢測
　　 提取細胞核蛋白并經(jīng)Bradford法定量至同等濃度，再以電泳遷移率變動分析法(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)檢測NF-κB活性，NF-κB探針采用[γ-32p]ATP標記。為保證實驗特異性，

16、每次實驗均設(shè)立陰性對照、陽性對照、特異性競爭對照和非特異性競爭對照。
　　 4.2DG攝取率檢測
　　 六組細胞分別行基礎(chǔ)2DG攝取率檢測和胰島素刺激后2DG攝取率檢測，方法同前。并比較各組細胞凈胰島素刺激的2DG攝取率(胰島素刺激后2DG攝取率-基礎(chǔ)2DG攝取率)。
　　 5.GLUT4總蛋白和膜蛋白檢測
　　 分別用100nM胰島素干預(yù)前述六組細胞，并加設(shè)一組未經(jīng)胰島素作用的肌管細胞作為基礎(chǔ)狀態(tài)下陰性

17、對照組，分別提取細胞的總蛋白和膜蛋白，WesternBlotting檢測GLUT4總蛋白和膜蛋白的表達。
　　 6.胰島素信號蛋白檢測
　　 六組細胞分別提取細胞總蛋白，Western Blotting檢測胰島素刺激后的IRS-1蛋白表達及其磷酸化、AKT蛋白表達及其磷酸化。
　　 7.統(tǒng)計分析
　　 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(means±SD)形式表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANO