蒲黃總黃酮對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下葡萄糖代謝及IL-6表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 1.在正常培養(yǎng)C2C12骨骼肌細(xì)胞的基礎(chǔ)上,模擬胰島素抵抗患者體內(nèi)脂質(zhì)浸潤(rùn)的特點(diǎn),建立胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞模型。
　　 2.觀測(cè)正常培養(yǎng)狀態(tài)下以及棕櫚酸(Palmitate)造成胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下,中藥提取物蒲黃總黃酮(PTF)對(duì)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的影響,了解PTF有無(wú)促進(jìn)葡萄糖代謝和改善胰島素抵抗的作用。
　　 3.進(jìn)一步觀察PTF對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型白細(xì)胞介素6(IL-6)表達(dá)的影響

2、,探討其改善骨骼肌胰島素抵抗的可能作用機(jī)制,為深入探討PTF改善胰島素抵抗的細(xì)胞分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:在Palmitate培養(yǎng)環(huán)境下,以3H-葡萄糖攝取試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)建立IR骨骼肌細(xì)胞模型;XTT比色法觀察藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響；Real—time PCR檢測(cè)IL-6mRNA的表達(dá)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的蛋白含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞模型的建立;

3、0.25mmol/L棕櫚酸(Palmitate)培養(yǎng)C2C12骨骼肌細(xì)胞16h,結(jié)果顯示palmitate培養(yǎng)下的C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率下降30.43％,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞模型建立。
　　 2.PTF對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝的影響葡萄糖消耗試驗(yàn)檢測(cè)PTF對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖的消耗及細(xì)胞活力的影響:XTT結(jié)果顯示,培養(yǎng)液中加入的PTF濃度為0.125～1.0g/L時(shí),

4、細(xì)胞活性未受明顯影響,但當(dāng)濃度達(dá)到2.0 g/L時(shí),XTT的OD值明顯下降:0.5g/L PTF干預(yù)正常C2C12骨骼肌細(xì)胞3h、6h、12h、16h、24h,發(fā)現(xiàn)其均可促進(jìn)葡萄糖消耗,且呈一定的時(shí)間依賴效應(yīng),羅格列酮(ROS)(5μmol/L)與PTF相比,促進(jìn)葡萄糖消耗的能力更為明顯；0.25mmol/L Palmitate培養(yǎng)C2C12骨骼肌細(xì)胞,加不同濃度的PTF(0.125～2.0 g/L)和ROS(5μmol/L)干預(yù)16h

5、,結(jié)果顯示:與正常組相比,模型組葡萄糖消耗量下降34.66％；而當(dāng)PTF濃度為0.25～1.0g/L時(shí),葡萄糖消耗量增加,與模型組相比,分別增加了25.22％,50.43％,75.65％,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,當(dāng)PTF濃度為0.125 g/L和2.0 g/L時(shí),差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROS組與0.25g/L、0.5g/L PTF組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3H-葡萄糖的攝取試驗(yàn)檢測(cè)PTF對(duì)C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響PTF

6、可促進(jìn)胰島素抵抗的C2C12骨骼肌細(xì)胞3H-葡萄糖攝取。0.5 g/L的PTF葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率為模型組的132.39％,5μmol/L ROS葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率為模型組的145.88％,與模型組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；PTF與ROS組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 加入核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)阻滯劑--pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)后,再次檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取,結(jié)果表明:模型組葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率與未加之

7、前相比提高了32.40％,PTF組、ROS組的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)率與未加PDTC之前相比,分別提高了47.46％和26.26％。
　　 3.PTF對(duì)骨骼肌細(xì)胞白細(xì)胞介素6(IL-6)mRNA表達(dá)的影響Real-time PCR結(jié)果顯示:Palmitate培養(yǎng)條件下,模型組IL-6 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng),是正常對(duì)照組的3.5倍；加入NF-κB抑制劑PDTC后,模型組IL-6 mRNA表達(dá)下調(diào)；加入PTF和ROS后,IL-6 mRNA的表達(dá)

8、受到明顯抑制；而在加入PDTC后,PTF和ROS組又分別使IL-6mRNA的表達(dá)增強(qiáng),分別是原來(lái)的1.30倍和1.42倍,PTF組與ROS組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反映PTF和ROS抑制IL-6 mRNA的作用因PDTC的加入而受到影響。
　　 4.PTF對(duì)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6蛋白含量的影響模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6蛋白含量明顯增加,為(612.58±18.60)pg/ml,與正常組相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；加入PDTC后

9、,模型組IL-6蛋白含量為(299.48±11.16)pg/ml(p<0.01)；加入PTF、ROS后,IL-6蛋白含量明顯下降,分別為(239.31±10.69)pg/ml和(251.27±11.44)pg/ml,與模型組相比,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；PTF、ROS組在加入PDTC后IL-6蛋白含量升高,分別為(323.08±9.69)pg/ml和(351.81±10.47)pg/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PTF與ROS組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

10、；同樣反映PTF和ROS抑制IL-6蛋白的作用因PDTC的加入而受到影響。
　　 結(jié)論:
　　 1、棕櫚酸(Palmitate)誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h明顯抑制C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖的攝取,此方法可成功建立骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型,適用于對(duì)胰島素抵抗具有潛在作用的中西藥物的篩選及其機(jī)制研究。
　　 2、PTF在不產(chǎn)生細(xì)胞毒作用的前提下,可明顯促進(jìn)胰島素抵抗模型骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗和攝取,揭示其能增加骨骼肌細(xì)胞對(duì)胰島素

11、的敏感性、改善胰島素抵抗。
　　 3、Palmitate可上調(diào)IL-6 mRNA及蛋白表達(dá),PTF可以抑制Palmitate培養(yǎng)下骨骼肌細(xì)胞IL-6 mRNA及蛋白表達(dá),這一作用可因加入核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)阻滯劑--pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC)而受到抑制,反映其作用途徑可能與NF-κB有關(guān)。
　　 4、PTF影響C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取以及細(xì)胞因子IL-6表達(dá)的效應(yīng)可能