Mfn2對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激與胰島素抵抗的影響.pdf

1、近年來,全球2型糖尿病的患病率迅速增加,已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅公眾健康的慢性疾病。胰島素抵抗是2型糖尿病重要的發(fā)病機(jī)制,線粒體在機(jī)體能量代謝和供給中起著核心作用,已有研究表明線粒體功能障礙與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)。線粒體功能異常包括線粒體氧化磷酸化能力降低,ATP合成減少,脂質(zhì)沉積,氧化應(yīng)激水平增加等。
　　 線粒體融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)是鑲嵌于線粒體外膜上的一種蛋白,研究發(fā)現(xiàn),Mfn2不僅有維持線粒體形態(tài)的

2、作用,其在線粒體代謝及改善胰島素敏感性中也起重要的作用。糖尿病、肥胖及運(yùn)動(dòng)等均可調(diào)節(jié)Mfn2的表達(dá)。我們的前期研究也表明,高脂飲食干預(yù)可以導(dǎo)致大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗,并且與大鼠骨骼肌組織中Mfn2表達(dá)下降有關(guān)。
　　 Mfn2導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制尚不明確。本研究擬通過高脂干預(yù)及腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)肌細(xì)胞Mfn2的表達(dá),測定氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo),在細(xì)胞水平探討Mfn2與氧化應(yīng)激、胰島素抵抗的關(guān)系。
　　 目的:探討Mfn2是否通過調(diào)

3、節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激影響大鼠骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗。
　　 方法:培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化大鼠L6成肌細(xì)胞,L6成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化為骨骼肌細(xì)胞后,將骨骼肌細(xì)胞隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照(NC)組和棕櫚酸(PA)組,建立高脂誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗模型。將正常對(duì)照(NC)組隨機(jī)分為4個(gè)亞組:正常對(duì)照(NC)組,正?？詹《?NAd0)組,Mfn2過表達(dá)(Mfn2)組,Mfn2敲低(siMfn2)組;將棕櫚酸(PA)組隨機(jī)分為3個(gè)亞組:棕櫚酸(PA)組,高

4、脂空病毒(PAd0)組,高脂Mfn2-腺病毒(PMfn2)組。以空腺病毒轉(zhuǎn)染NAd0組、PAd0組,siMfn2基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染siMfn2組,Mfn2基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染Mfr2、PMf2組。轉(zhuǎn)染成功(以各組細(xì)胞Mfn2的mRNA及蛋白表達(dá)水平鑒定腺病毒轉(zhuǎn)染是否成功)后,檢測各組細(xì)胞葡萄糖利用率評(píng)價(jià)胰島素敏感性,裝載JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位(Δψm)、DHE熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)含量;相應(yīng)試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)總超氧化

5、物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力及丙二醛(MDA)含量;采用Western-blot的方法檢測c-Jun氨基末端激酶(JNK)、核因子-κB(NF-κB)蛋白表達(dá)量及其磷酸化水平。采用單因素方差分析,兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.骨骼肌細(xì)胞經(jīng)高脂干預(yù)后各指標(biāo)的變化:與NC組相比,PA組骨骼肌細(xì)胞胰島素敏感性下降,Mfn2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平明顯降低

6、,線粒體膜電位水平、T-SOD、CAT及GSH-Px活性明顯降低,ROS、MDA含量、JNK、NF-κB的磷酸化水平均明顯增加。
　　 2.調(diào)節(jié)正常肌細(xì)胞Mfn2表達(dá)各指標(biāo)的變化:骨骼肌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空腺病毒、Mfn2基因重組腺病毒、siMfn2基因重組腺病毒,與NC組相比,NAd0組各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯變化;Mfn2組細(xì)胞Mfn2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著增高(P＜0.01),骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取率明顯增加,線粒體膜電位水平,R

7、OS、T-SOD、CAT活性,JNK、NF-κB的磷酸化水平無明顯差異,MDA含量降低;siMfn2組細(xì)胞Mfn2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.01),骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取率明顯降低,線粒體膜電位水平、T-SOD及CAT活性明顯降低,ROS、MDA含量、JNK、NF-κB的磷酸化水平明顯增加。
　　 3.上調(diào)高脂干預(yù)后的肌細(xì)胞Mfn2表達(dá)后各指標(biāo)的變化:與高脂(PA)組相比,PAd0組各項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;上調(diào)M

8、fn2的表達(dá)后,PMfn2組骨骼肌細(xì)胞Mfn2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均增加(P＜0.01),骨骼肌細(xì)胞葡萄糖攝取率明顯升高(P＜0.01),線粒體膜電位水平、T-SOD及CAT活力均明顯增加;ROS、MDA含量、JNK、NF-κB磷酸化水平明顯降低,細(xì)胞氧化應(yīng)激水平明顯降低;GSH-Px活力、JNK、NFκB蛋白表達(dá)量無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.高脂干預(yù)骨骼肌細(xì)胞后,Mfn2表達(dá)水平降低,細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀