FoxO1在氧化應激誘導糖異生-胰島素抵抗機制中的作用.pdf

1、目的:通過H2O2干預BRL-3A大鼠肝細胞建立體外大鼠肝細胞氧化應激損傷模型并予以藥物干預,觀察核轉錄因子FoxO1蛋白的表達和FoxO1乙?；郊捌渖嫌我葝u素信號通路因子Akt、p-Akt蛋白表達變化,及對糖異生的影響,從新的角度完善氧化應激／胰島素抵抗的發(fā)生機制,為研究開發(fā)既能有效抑制氧化應激及炎癥損傷,又能改善胰島素抵抗的的新藥提供理論依據。
　　 方法:體外培養(yǎng)正常大鼠肝細胞(BRL-3A),生長達60-70％融合后

2、,無血清培養(yǎng)進同步化24h隨即分為5組:1.正常細胞環(huán)境組:A:空白對照組,含10％FBS的DMEM培養(yǎng)24小時；B:尼克酰胺(NAM)組,含尼克酰胺10mmol／L的培養(yǎng)基作用24小時；2.氧化應激模型組:C:H2O2組,含100umol／LH2O2培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時；D:H2O2+尼克酰胺(NAM)組；E:H2O2+還原性谷胱甘肽(GSH)組(D組和E組先用含100umol／L的H2O2培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時后再分別予以10mmol／L尼克

3、酰胺培養(yǎng)液和5 mmol／L還原性谷胱甘肽培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時),以上每組細胞干預培養(yǎng)液中均含有100nM胰島素。Western印跡法(WB)定量檢測各組細胞Akt、p-Akt、FoxO1蛋白表達水平,免疫沉淀(IP)和WB檢測各組FoxO1蛋白乙?；?RT-PCR檢測糖異生關鍵酶PEPCK和G-6-Pase基因表達水平。
　　 結果:(1)氧化應激細胞模型建立:100umol／L的H2O2干預細胞后,細胞丙二醛(MDA)含量

4、隨時間延長逐漸增加,2h后MDA含量增加更為顯著,呈現明顯的細胞損傷效應。(2)實驗各組Akt、p-Akt、FoxO1、乙酰化FoxO1蛋白表達水平的變化:各組細胞Akt蛋白表達量無明顯差異；氧化應激細胞模型各組(C,D,E組)FoxO1蛋白表達量明顯高于正常細胞環(huán)境組(A,B組),差異具有統計學意義(p<0.01),但模型組組內差異不顯著(p≥0.05)；與空白對照組相比,尼克酰胺組(B組)p—Akt蛋白和乙?；疐oxO1蛋白均有所增

5、加,H2O2組(C組)兩者表達量均最低(p<0.01)；與H2O2組相比,H2O2處理后再予以尼克酰胺干預,細胞p-Akt和乙?；疐oxO1蛋白表達有不同程度的增加(p<0.01),予以還原性谷胱甘肽干預細胞p-Akt蛋白表達水平有所增加(p<0.01),但FoxO1蛋白表達及乙?；綗o明顯變化(p≥0.05)。(3)各組PEPCK和G-6-P mRNA的表達情況:與空白對照組相比,尼克酰胺組的PEPCK和G-6-Pase mRNA表

6、達明顯減少(p<0.01),H2O2組PEPCK和G-6-Pase mRNA表達最高(p<0.01)；與H2O2組相比,H2O2+尼克酰胺組和H2O2+還原性谷胱甘肽組PEPCK和G-6-PasemRNA表達有不同程度降低(p<0.05)。
　　 結論:(1)100umol／1的H2O2可以對體外培養(yǎng)BRL-3A大鼠肝細胞造成氧化損傷,損傷程度成時間依賴性。(2)尼克酰胺不影響FoxO1蛋白表達水平但能明顯增加其乙?；?抑制

7、糖異生關鍵酶基因PEPCK,G-6-Pase表達,改善胰島素抵抗,間接證實Sirt1去乙?；疐oxO1會降低FoxO1乙?；?從而增加FoxO1活性。(3)氧化應激能夠增加FoxO1蛋白的表達水平,并通過激活Sirt1間接降低FoxO1蛋白乙?；?增加糖異生關鍵酶基因PEPCK,G-6-Pase表達,促進肝臟糖異生,導致胰島素抵抗,這可能是氧化應激誘導胰島素抵抗的分子機制之一。另外本實驗意外發(fā)現氧化應激同時能降低FoxO1上游因