胰島素抵抗大鼠胰島及HIT-T15細胞氧化應激與自吞噬的研究.pdf

1、觀察高脂飼養(yǎng)大鼠胰島素抵抗時胰島β細胞是否發(fā)生自吞噬現(xiàn)象，并探討胰島氧化應激與胰島β細胞自吞噬的關系。 材料與方法： 40只雄性Wistar大鼠，分為單純高脂和正常飼料組，每組又分為5個亞組，分別代表5個階段，大鼠喂養(yǎng)至10、14、16、18、20周時分階段處死。所有動物處死前，禁食14小時，麻醉后尾靜脈取血測血糖，并心臟取血分別檢測血清或血漿中胰島素、甘油三酯、膽固醇、FFA等指標，并迅速取出胰腺、肝臟、腎臟(肝臟、腎臟備第

2、二部分用)，取部分胰腺組織做冰凍切片及電鏡觀察，部分分離純化胰島，液氮凍存，待標本收齊后，作組織勻漿，采用BCA蛋白定量法，測定組織中蛋白濃度，采用比色法測定胰島組織勻漿中SOD及MDA的含量。采用MDC(monodansylcadaverine)染色胰腺組織冰凍切片，并進行激光共聚焦顯微鏡熒光定量以及透射電鏡直接觀察自吞噬泡來觀察胰島自吞噬現(xiàn)象的發(fā)生。所有標本結果以均數(shù)±標準差表示。每一個亞組均與同期對照比較并進行亞組間比較作統(tǒng)計分析

3、。 發(fā)現(xiàn)：1．高脂飼養(yǎng)大鼠在飼養(yǎng)10周以后體重明顯高于正常，腹型肥胖形成(VF／W值3.9±0.15 vs.2.4±0.1，p<0.05)，同時伴有高胰島素血癥(1.05±0.18 vs.0.52±0.02，p<0.05)、高甘油三酯(1.37±0.22 vs.0.66 ±0.05,p<0.05)、高膽固醇血癥(1.02±0.02 vs．0.78±0.05，p<0.05)、高游離脂肪酸血癥(451±20vs.408±13

4、，p<0.05)，胰島素敏感指數(shù)下降(0.38±0.02 vs.1.35±0.21，p<0.05)、HOMA-IR指數(shù)升高(0.33±0.05vs0.15±0.02，p<0.05)。2．在14周末時，胰島組織內(nèi)SOD活力下降，至20周末時，下降顯著(1.32±0.27 vs.9.47±0.86，p<0.01)，并隨著年齡增長呈下降趨勢，同時，胰島組織內(nèi)MDA含量增高，隨著時間延長，呈增高趨勢，20周末時明顯增高(3.23±O.18 VS

5、.1.2±0.23，p<0.01)。3．電鏡觀察：16周末時，胰島β細胞內(nèi)有線粒體腫脹；18周末時，我們可看到β細胞內(nèi)染色質(zhì)固縮，線粒體腫脹樣變，胞漿內(nèi)見有少量圓形或橢圓形空泡樣改變,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒減少，輕度擴張；20周末時，我們看到全視野下，胞漿內(nèi)分泌顆粒減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，表面顆粒減少，胞漿內(nèi)有較為多量的圓形或橢圓形空泡，未見初級溶酶體或次級溶酶體改變。4．激光掃描共聚焦顯微鏡定量分析胰島內(nèi)MDC熒光強度，各個時段內(nèi)正常組與對照組

6、比較均無統(tǒng)計學差異，各個時段縱向比較亦無統(tǒng)計學差異。 結論和解釋 1.10周末時，高脂飼養(yǎng)大鼠已經(jīng)形成穩(wěn)定的胰島素抵抗模型。2．全身胰島素抵抗狀態(tài)下，隨時間推移，胰島組織內(nèi)氧化應激增加。3．在20周內(nèi)，無確切的證據(jù)表明胰島B細胞發(fā)生了自吞噬現(xiàn)象。4．然而在20周末的胰島素抵抗大鼠胰島β細胞胞漿內(nèi)觀察到有多量的空泡樣結構，其是否為前自吞噬體，需要進一步的研究證實。隨著胰島內(nèi)氧化應激的加重，胰島β細胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，表面顆粒減少，

7、蛋白質(zhì)合成受損，發(fā)生了胰島β細胞功能障礙。 研究目的：觀察高糖高脂刺激β細胞株HIT-T15細胞時氧化應激變化及細胞的自吞噬現(xiàn)象。 材料與方法：胰島β細胞株HIT-T15細胞按照干預因素及時間不同，分為以下六組：①正常培養(yǎng)24小時組(含5.5 mmol／1葡萄糖的1640培養(yǎng)液)②正常培養(yǎng)48小時組(含5.5 mmol／l葡萄糖的1640培養(yǎng)液)③0.5mmol／1 FFA、5/5 mmol／1葡萄糖培養(yǎng)24小時組④0.

8、5mmol／1 FFA、5.5mmol／1葡萄糖培養(yǎng)48小時組⑤含16.7 mmol／1葡萄糖1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時組⑥含16.7 mmol／1葡萄糖1640培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時組。各組細胞分別觀察以下指標：1．放射免疫分析法檢測基礎胰島素及糖刺激胰島素分泌的變化。2．流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平的變化。3．各組細胞MDC染色10分鐘后，熒光顯微鏡觀察、照片并激光掃描共聚焦顯微鏡定量分析MDC熒光強度。 結果與發(fā)現(xiàn)：1．16

9、.7 retool／1葡萄糖刺激HIT-TI5細胞24小時后，基礎胰島素分泌增加(40.9±10.6 vs 13.0±0.05)，糖刺激胰島素分泌(GSIS)減少(4.6±1.68 vs 12.5±0.03)；刺激48小時后，同樣基礎胰島素分泌增加(44.4±18.6 vs 14.8±0.12)，GSIS減少(3.6±0.9 vs 12.8±0.1)，但這兩組比較無統(tǒng)計學差異。2．0.5mmol／l FFA刺激HIT-T15細胞24小時

10、后，基礎胰島素分泌增加(40.9±12.4 vs 13.0±0.05)，GSIS減少(5.6±1.2 vs 12.5±0.03)，刺激48小時后，基礎胰島素分泌繼續(xù)增加(43.4±13.0 VS 14.8±0.12)，GSIS減少(3.2±1.3 vs 12.8±0.1)。3．16.7 mmol／1葡萄糖刺激HIT-T15細胞24及48小時后，細胞內(nèi)ROS水平隨刺激時間延長而逐漸增加(39.9±27.3[24h]／55.8±51.1[4

11、8h]vs 6.96±3.58)4.0.5 mmol／1FFA刺激HIT-T15細胞24、48小時后，細胞內(nèi)ROS水平高于隨刺激時間延長而增加(38.1±26.1[24h]／81.1±71.5[48h]vs 6.96±3.58[N])，且48小時末，高脂刺激組細胞內(nèi)ROS水平高于高糖組(81.1±71.5 vs 55.5±51.1)，這提示我們高糖高脂刺激可導致細胞內(nèi)氧化應激水平增加。5.16.7 mmol／1葡萄糖刺激HIT-T15

12、細胞24及48小時后，細胞內(nèi)MDC熒光強度增加(27.5±6.9[24h]／30.9±4.9[48]VS 20.4±4.0)，O.5 mmol／1FFA刺激HIT-T15細胞24及48小時后，細胞內(nèi)MDC熒光強度亦增加(30.4±3.4[24h]／26.9±5.1 [48h]VS 20.0±4.O)，但高糖高脂處理組間比較無統(tǒng)計學差異，提示高糖高脂處理后可出現(xiàn)細胞內(nèi)MDC標記的結構增加，即可能細胞內(nèi)自吞噬活性增加。 研究目的：胰

13、島素抵抗大鼠胰島、肝臟、腎臟氧化應激的變化與二甲雙胍、羅格列酮干預后對其的影響材料與方法：76只雄性wistar大鼠，分為三部分： (A)：40只隨機分為兩大組，即高脂組和正常對照組，每個大組再分為5個亞組(10、14、16、18、20周)，每組4只動物，按照實驗設計分階段處死動物。(*注：同第一部分)(B)：18只Wistar大鼠，高脂飲食8周后，稱重，尾靜脈取血測定血糖、血脂、胰島素、FFA水平，計算ISI、HOMA-IR。然后隨

14、機分為三組，單純高脂組，高脂+二甲雙胍組，高脂+羅格列酮組，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后處死動物。 (C)：18只動物，稱重并隨機分為三組，同B，高脂飼養(yǎng)同時即開始灌胃二甲雙胍及羅格列酮，8周末處死動物。二甲雙胍300mg／kg／d,羅格列酮4mg／kg／d進行灌胃。所有動物處死前，禁食14小時，麻醉后尾靜脈取血測血糖，并心臟取血分別檢測血清或血漿中胰島素、甘油三酯、膽固醇、FFA等指標，并迅速取出胰腺、肝臟、腎臟凍存于液氮罐中。標本收齊后，比色法

15、測定肝臟、腎臟組織勻漿中SOD及MDA含量。所有標本結果以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗和方差分析。 結論：本實驗觀察了胰島素抵抗時胰島、肝臟、腎臟氧化應激的變化和二甲雙胍、羅格列酮干預后對氧化應激的影響。結果有以下發(fā)現(xiàn)：1．胰島素抵抗大鼠在尚未出現(xiàn)明顯糖代謝紊亂的情況下，胰島、肝臟、腎臟組織中就已經(jīng)發(fā)生了氧化應激 2 二甲雙胍與羅格列酮能夠改善胰島、肝臟、腎臟的氧化應激，尚未形成胰島素抵抗時，可保護機體抗氧化防護系統(tǒng)。一