津力達(dá)對高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗及肝臟氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、胰島素抵抗是指外周靶器官對胰島素作用的敏感性下降。目前認(rèn)為，胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，也是多種代謝性疾病如肥胖、代謝綜合癥的共同病理生理基礎(chǔ)。研究表明游離脂肪酸、炎癥、細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激等多種因素共同參與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展。
　　研究表明氧化應(yīng)激是引起胰島素抵抗的關(guān)鍵性因素。過量攝入高脂飲食可導(dǎo)致機體能量過剩，脂質(zhì)異位沉積于肌肉及肝臟，造成活性氧簇(ROS)生成過多，機體氧化應(yīng)激水平顯著增加。已證實2型糖尿病(T2D

2、M)患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，導(dǎo)致核酸、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)等多種生物大分子受到不同程度的氧化損傷。最近的研究表明氧化應(yīng)激可顯著抑制胰島素信號通路。因此氧化應(yīng)激高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗中起著至關(guān)重要的作用，而抗氧化治療可能在一定程度上治療或預(yù)防胰島素抵抗。
　　津力達(dá)是由人參、黃精、蒼術(shù)（炒）、苦參等17味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，臨床試驗證實其可有效降糖，改善2型糖尿病患者的癥狀。既往研究表明津力達(dá)可保護(hù)胰島β細(xì)胞，增加胰島素分泌，改善胰島素

3、抵抗，降低血清炎癥因子水平，降低血脂水平。但津力達(dá)通過何種機制改善胰島素抵抗仍不明確。黃精作為津力達(dá)的主要成分之一，具有明確的抗氧化作用，由此我們提出假設(shè)，津力達(dá)是否通過抗氧化作用減輕胰島素抵抗呢？
　　本研究首先建立了高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型，其后進(jìn)一步評價了津力達(dá)對高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗的影響，并檢測了肝臟氧化應(yīng)激水平、胰島素信號通路及應(yīng)激信號通路的蛋白及基因表達(dá)，探討氧化應(yīng)激與胰島素抵抗的關(guān)系，從而揭示津力達(dá)改善胰島

4、素抵抗的分子機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。
　　目的:研究中藥復(fù)方制劑津力達(dá)對高脂喂養(yǎng)的大鼠胰島素抵抗及肝臟氧化應(yīng)激的影響，探討津力達(dá)改善胰島素抵抗的機制。
　　方法:雄性SD大鼠48只(體重125g-145g)，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分為2組:正常對照組(Con)12只，高脂飲食組(HF)36只，正常對照組給予予普通飼料喂養(yǎng)，熱量組成:碳水化合物65.5％，脂肪10.3％，蛋白質(zhì)24.2％，總熱量為348kcal/100g

5、;高脂飲食組給予高脂飼料喂養(yǎng)，熱量組成:碳水化合物20.1％，脂肪59.8％，蛋白質(zhì)占20.1％，總熱量為501kcal/100g。為評估大鼠整體胰島素敏感性，于喂養(yǎng)后6周后每組隨機選6只大鼠，行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗，腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT)，計算葡萄糖輸注率(GIR)、葡萄糖曲線下面積(AUCglu);隨后處死大鼠，留取血及肝臟組織標(biāo)本。測定大鼠空腹血糖(FBG)、血清胰島素(FINS);油紅O染色觀察大鼠肝臟形態(tài)變

6、化。6周高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠成模后，將剩余高脂飲食大鼠隨機分為五組(n=6):高脂組（HF）、津力達(dá)低劑量組，（JLD-L）(0.75g/kg)、津力達(dá)中劑量組(JLD-M)（1.5g/kg）、津力達(dá)高劑量組(JLD-H)(3.0g/kg)和二甲雙胍組(Met)(0.2g/kg)，正常飲食組(Con)繼續(xù)喂以普通飼料，分別干預(yù)8周。于第8周行高胰島素-正葡萄糖鉗夾和IPGTT試驗，計算AUCglu和GIR;其后處死大鼠，留取血清及

7、肝臟標(biāo)本，測定FBG、FINS、TC、TG、游離脂肪酸(FFA)糖化血紅蛋白(HbA1c)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、計算HOMA-IR指數(shù);測定肝臟脂質(zhì)過氧化物(LPO)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量，檢測總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)的活性，DHE熒光探針檢測肝細(xì)胞活性氧簇(ROS)含量;Real-Time PCR檢測肝臟胰島素信號通路

8、胰島素受體(INSR)、胰島素受體底物-1（IRS-1）、蛋白激酶β(AKT)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2(GLUT2)的mRNA表達(dá)水平;Western Blot檢測肝臟c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、IRS-1、AKT的總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)水平;油紅O染色、電鏡觀察大鼠肝臟形態(tài)變化。
　　結(jié)果:
　　1.高脂飲食喂養(yǎng)6周后，各項指標(biāo)變化:
　　(1

9、)體重及攝食量:兩組大鼠實驗起始體重?zé)o明顯差異，飼料喂養(yǎng)6周后，高脂組大鼠體重高于對照組(P＜0.05)，每日平均攝入熱量兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。提示高脂飲食喂養(yǎng)引起的體重增長并不依賴于攝食量的增加。
　　(2)血液生化指標(biāo):與對照組相比，高脂組大鼠FBG、FINS、 HOMA-IR均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT):與對照組相比，高脂組0'、5'、6

10、0'、120'血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與對照組相比，高脂組葡萄糖曲線下面積(AUCglu)顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示高脂組大鼠餐后血糖高峰后延。
　　(4)高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗:計算各組大鼠葡萄糖輸注率(GIR)，高脂組大鼠GIR明顯低于正常對照組（減少47％），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示高脂組大鼠出現(xiàn)明顯胰島素抵抗。
　　(5)肝臟油紅O染色:高脂組肝細(xì)

11、胞可見大量脂滴，提示肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和脂肪變性。
　　2.藥物干預(yù)8周后，各項指標(biāo)變化:
　　(1)體重及攝食量:在第8周末，高脂組大鼠體重明顯高于對照組(P＜0.05);而津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)組體重較高脂組明顯減輕(P＜0.05)，但仍高于對照組（P＜0.05）。高脂組大鼠日均攝食量明顯高于對照組(P＜0.05)，而津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)組日均攝食量與高脂組及對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。提示提示津力達(dá)可降低高脂組大

12、鼠體重，且其減重作用不依賴于攝入熱量的減少。
　　(2)血液生化指標(biāo):高脂組FBG、HbA1c、TG、ALT、AST均對照組明顯增加(P＜0.05)，津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)后，上述指標(biāo)均顯著低于高脂組(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)，且津力達(dá)降脂效果優(yōu)于二甲雙胍。高脂組FINS、FFA、較對照組明顯增加，津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)后FINS、FFA低于高脂組(P＜0.05)，且與正常對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。高

13、脂組TC與對照組無明顯差異（P＞0.05），津力達(dá)及二甲雙胍治療后TC顯著低于高脂組(P＜0.05)。高脂組TBIL較對照組有升高趨勢，幾組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　(3)整體胰島素敏感性評估:高脂組GIR較對照組明顯降低（P＜0.05），津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)后GIR明顯升高（P＜0.05）。IPGTT結(jié)果示:高脂組0'、5'、30'、60'、120'血糖均較對照組升高（P＜0.05），津力達(dá)干預(yù)后30'、60'血糖較

14、高脂組下降，二甲雙胍干預(yù)后5'、30'、60'、120'血糖較高脂組下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。高脂組大鼠AUCglu高于對照組(P＜0.05)，經(jīng)津力達(dá)及二甲雙胍治療后AUCglu顯著低于高脂組，但仍高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示高脂組大鼠發(fā)生胰島素抵抗，津力達(dá)干預(yù)后大鼠糖耐量改善，胰島素敏感性有所恢復(fù)。
　　(4)肝臟胰島素敏感性:與對照組相比，高脂組大鼠INSR、IRS-1、PI3K、AK

15、T、GLUT2的mRNA表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與高脂組相比，津力達(dá)干預(yù)上調(diào)INSR、IRS-1、AKT、GLUT2的mRNA表達(dá)（P＜0.05），而對PI3K無明顯影響(P＞0.05);二甲雙胍干預(yù)均可上調(diào)INSR、IRS-1、PI3K、AKT、GLUT2的mRNA表達(dá)（P＜0.05）。與對照組相比，高脂組p-IRS-1/IRS-1比值顯著升高，p-AKT/AKT比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);

16、與高脂組相比，津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)組p-IRS-1/IRS-1比值顯著降低，p-AKT/AKT比值顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示高脂組大鼠肝臟對胰島素敏感性降低，胰島素信號傳導(dǎo)減弱，而津力達(dá)干預(yù)后大鼠肝臟胰島素敏感性有所恢復(fù)。
　　(5)肝臟氧化應(yīng)激:與對照組相比，高脂組大鼠肝臟ROS生成明顯增加，LPO含量明顯增多，GSH含量明顯下降，抗氧化酶GSH-Px、SOD明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;

17、兩組間CAT活力無明顯差異（P＞0.05）。津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)后，ROS、LPO含量較高脂組減少（P＜0.05），GSH含量、GSH-Px、SOD、CAT活力較高脂組增高（P＜0.05）。提示津力達(dá)可減少肝臟的氧化應(yīng)激。
　　(6) JNK、p38MAPK信號通路:與對照組相比，高脂組p-JNK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK比值顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與高脂組相比，津力達(dá)及二甲雙胍干預(yù)組p-J

18、NK/JNK和p-p38MAPK/p38MAPK比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示津力達(dá)可抑制JNK和p38MAPK信號通路。
　　(7)油紅O染色及透射電鏡觀察:油紅O染色:高脂組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂質(zhì)沉積及脂肪變性，津力達(dá)各劑量組及二甲雙胍組均可不同程度地減輕肝臟脂質(zhì)沉積及脂肪變性。電鏡觀察:高脂組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂滴，線粒體嵴斷裂或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張;津力達(dá)各劑量組及二甲雙胍組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量、

19、體積明顯減少，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕。
　　結(jié)論:
　　1.津力達(dá)可改善大鼠糖耐量異常，減輕胰島素抵抗，糾正高血糖癥、高胰島素血癥、高脂血癥等代謝紊亂，且津力達(dá)降脂效果優(yōu)于二甲雙胍。
　　2.津力達(dá)可改善大鼠肝功能，減少肝臟脂質(zhì)沉積，減輕肝臟脂肪變性程度。
　　3.津力達(dá)可改善大鼠肝臟氧化應(yīng)激，減少ROS生成，降低LPO含量，恢復(fù)抗氧化酶如SOD、GSH-Px、CAT活性，增加GSH含量。