蛻皮甾酮對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肝糖異生的影響.pdf

1、目的:糖尿病是一種由胰島素分泌缺乏或胰島素抵抗導(dǎo)致的以血糖升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病,其發(fā)病率逐年上升,關(guān)于其發(fā)病機(jī)制及治療手段的研究也日益深入,2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制研究中,又以胰島素抵抗的產(chǎn)生機(jī)制為主要研究對(duì)象,近年來,越來越多研究表明氧化應(yīng)激在胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。其具體機(jī)制尚不十分明確;肝臟糖異生作為體內(nèi)糖代謝的重要環(huán)節(jié),其兩個(gè)關(guān)鍵酶PEPCK、G-6-Pase的表達(dá)對(duì)血糖水平具有決定性意義;蛻皮甾酮在糖尿病及其

2、相關(guān)并發(fā)癥方面的作用如增加葡萄糖消耗,抗氧化應(yīng)激等也已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí),故本實(shí)驗(yàn)取正常大鼠的肝細(xì)胞建立體外大鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型,后予以各濃度蛻皮甾酮(ecdysterone,ECR)進(jìn)行損傷后再干預(yù),并用吡格列酮(Pioglitazone,PIG)作為陽性藥物對(duì)照,擬從細(xì)胞水平觀察氧化應(yīng)激及糖異生與胰島素抵抗的關(guān)系,通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)糖異生相關(guān)因子的表達(dá)水平的觀察,了解蛻皮甾體對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)糖異生的作用,間接尋找蛻皮甾酮改善胰島素抵抗的作用

3、機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)以正常大鼠肝細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型,從實(shí)驗(yàn)室購(gòu)得正常BRL-3A大鼠肝細(xì)胞株,予以高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)后,隨機(jī)分組:(1)正常細(xì)胞環(huán)境組:繼續(xù)予以高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),不加任何其他干預(yù)因素;(2)氧化應(yīng)激模型組:用含濃度為100umol/L雙氧水的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)4小時(shí);然后再隨機(jī)分成三組,一組停止培養(yǎng),提取蛋白并變性后-20℃保存,為單純雙氧水組;一組繼續(xù)予以蛻皮甾酮干預(yù),予以ECR1×10-6mmol/L,ECR1×10-7mm

4、ol/L, ECR1×10-8mmol/L三個(gè)濃度的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時(shí);一組予以陽性對(duì)照藥物吡格列酮干預(yù),予以含濃度為1×10-5mmol/L吡格列酮繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。各組培養(yǎng)基中均加入100nM的胰島素,以模擬正常細(xì)胞環(huán)境。結(jié)果:(1)藥物對(duì)BRL-3A細(xì)胞的影響:當(dāng)蛻皮甾酮濃度超過1×10-5mol/L濃度時(shí)細(xì)胞OD值開始出現(xiàn)明顯下降,提示此濃度范圍蛻皮甾酮可明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)(p<0.01),當(dāng)蛻皮甾酮濃度低于1×10-9mo

5、l/L時(shí),細(xì)胞OD值較高,提示小于此濃度的蛻皮甾酮對(duì)細(xì)胞影響過小,蛻皮甾酮濃度為1×10-6—1×10-8mol/L時(shí),細(xì)胞OD值在0.7左右,再結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),取此濃度作為實(shí)驗(yàn)所用蛻皮甾酮干預(yù)濃度;(2)實(shí)驗(yàn)各組Akt、p-Akt、FoxO1蛋白表達(dá)水平的變化影響:通過各組實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后對(duì)比發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)各組的Akt蛋白表達(dá)差異不具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01);與單純雙氧水組相比,后續(xù)再予以藥物干預(yù)各組細(xì)胞Akt磷酸化水平增高,p-

6、Akt蛋白表達(dá)有不同程度的增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01),其下游FoxO1蛋白的表達(dá)則出現(xiàn)不同水平的減少。(3)各組細(xì)胞FOXO1、PEPCK和G-6-Pase mRNA的表達(dá)情況:與空白對(duì)照組比較,僅用雙氧水處理后細(xì)胞PEPCK和G-6-Pase mRNA表達(dá)最高(p<0.01);相比之下,后續(xù)用蛻皮甾酮及吡格列酮干預(yù)的細(xì)胞PEPCK和G-6-Pase mRNA表達(dá)有不同程度降低(p<0.05)。結(jié)論:(1)高濃度的蛻皮甾酮

7、對(duì)BRL-3A大鼠肝細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用;(2)雙氧水干預(yù)后引起的氧化應(yīng)激損傷可使細(xì)胞內(nèi)FoxO1蛋白表達(dá)增加,使Akt磷酸化減少,同時(shí),糖異生關(guān)鍵酶PEPCK,G-6-Pase這兩個(gè)基因的表達(dá)增加,提示氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)糖異生,增加肝臟葡萄糖的輸出。(3)蛻皮甾酮干預(yù)后細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平不同程度升高提示蛻皮甾酮可增加Akt磷酸化水平,同時(shí)其下游FoxO1蛋白的表達(dá)水平也可受到抑制,PEPCK,G-6-Pase表達(dá)也有所下降,提示蛻皮