AAPH誘導氧化應激對胚胎成骨的影響.pdf

1、研究已證明氧化應激與胚胎發(fā)育不良有著密切聯(lián)系，骨骼系統(tǒng)的發(fā)育是胚胎發(fā)育的一個重要環(huán)節(jié)，然而關于氧化應激與胚胎骨骼發(fā)育的關系研究還報道尚少。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)高劑量自由基誘導劑誘導的氧化應激會導致胚胎肢芽發(fā)育畸形，本文將進一步深入探討氧化應激對胚胎骨生成的影響與作用機制。
　　首先，我們給予雞胚不同濃度的AAPH（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg）建立氧化應激雞胚模型。給予AAPH處理后，雞胚孵育至

2、12.5天，測定相關指標，確定建立慢性氧化應激雞胚模型的最佳劑量。結(jié)果顯示，雞胚的死亡率和畸形率隨著AAPH濃度的增加而增加，AAPH對雞胚的半數(shù)致死劑量為4.8μmol/egg。不同濃度的AAPH（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μmol/egg）均能造成雞胚氧化應激，例如骨骺軟骨細胞ROS生成速率增高，線粒體膜電位降低。我們確定0.5μmol/egg的AAPH作為建立慢性氧化應激雞胚模型的劑量，在此劑量下雞胚長骨長度

3、較正常組相比顯著性縮短。
　　其次，我們以AAPH（0.5μmol/egg）建立的氧化應激雞胚模型為基礎，探討氧化應激對胚胎軟骨內(nèi)成骨的影響，為此依次進行了以下實驗：（1）連續(xù)取16.5、17.5、18.5天雞胚長骨進行阿利新藍&茜素紅雙染，測量脛骨和股骨長度，檢測氧化應激對雞胚長骨生長速度的影響。結(jié)果顯示，AAPH誘導的氧化應激能顯著性減緩雞胚長骨的生長速度，縮短長骨長度。（2）連續(xù)取16.5、17.5、18.5天雞胚長骨進行石

4、蠟切片，H&E染色處理，分別測量其脛骨、股骨骨骺端軟骨細胞增殖區(qū)和軟骨細胞膨大區(qū)的長度，檢測氧化應激對雞胚長骨軟骨內(nèi)成骨的兩個關鍵步驟—軟骨細胞增殖和軟骨細胞膨大的影響。結(jié)果顯示，氧化應激顯著性縮短了雞胚長骨骨骺端軟骨細胞增殖區(qū)和膨大區(qū)的長度，導致雞胚長骨軟骨細胞增殖速度減慢，軟骨細胞膨大骨化速度降低。同時還發(fā)現(xiàn)雞胚長骨骨骺軟骨增殖區(qū)軟骨細胞總數(shù)減少，正處于分裂期的細胞數(shù)下降。（3）采用Micro-CT術(shù)檢測雞胚發(fā)育后期長骨的相關骨指標

5、，驗證氧化應激導致的胚胎骨發(fā)育不良。結(jié)果顯示，氧化應激顯著性降低了雞胚長骨的骨量和骨密度，導致胚胎不良的骨生成。（4）采用RT-PCR術(shù)檢測軟骨內(nèi)成骨的關鍵調(diào)控因子Sox9和Runx2以及相關基因Type II collagen和Aggrecan的基因表達。結(jié)果顯示，氧化應激顯著性降低了這些基因的表達水平。
　　綜上所述，AAPH（0.5μmol/egg）誘導的慢性氧化應激會導致胚胎長骨Sox9的表達下降，從而下調(diào)了Type II

6、 collagen和Aggrecan的表達，影響了軟骨細胞的生存、營養(yǎng)和代謝，抑制了軟骨細胞的增殖，減緩了長骨的生長發(fā)育速度。AAPH氧化應激誘導的Sox9蛋白量表達下降，會直接導致預膨大軟骨細胞中磷酸化Sox9蛋白的減少，導致預膨大軟骨細胞直接進入終末分化階段，發(fā)生凋亡，大大減少了成熟膨大軟骨細胞的數(shù)量，造成Runx2表達的降低，導致長骨的骨化不良、骨量和骨密度降低。本研究結(jié)果闡明了氧化應激對胚胎骨生成的影響，并初步揭示了具有臨床代表