FOXO1轉(zhuǎn)錄因子在胰島β細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、2型糖尿病(T2DM)是一種嚴(yán)重危害人類健康的代謝性疾病，胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損是。T2DM發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[1]。胰島β細(xì)胞是機(jī)體胰島素的唯一內(nèi)分泌細(xì)胞，其數(shù)量、體積及功能狀態(tài)決定了胰島素的分泌水平，對(duì)維持血糖恒定起重要作用[1]。胰島β細(xì)胞數(shù)量的維持主要取決于β細(xì)胞新生、增殖、肥大及凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡。T2DM患者，β細(xì)胞數(shù)量顯著低于非糖尿病者，最終導(dǎo)致胰島素分泌量不足，其機(jī)體能量代謝障礙，但其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明[2-5]。

2、 FOXO1是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及增殖、凋亡的重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛表達(dá)于糖、脂代謝的重要器官，如肝臟、脂肪和骨骼肌等[6-7]。最近研究顯示FOXO1亦表達(dá)在成人胰島中，Guerra等[8]從13例人的組織標(biāo)本中報(bào)道，2型糖尿病人的胰島中FOXO1的mRNA表達(dá)量顯著高于非糖尿病對(duì)照組，提示高表達(dá)FOXO1可能造成β細(xì)胞功能損傷。然而，對(duì)FOXO1在成熟β細(xì)胞中的作用尚不清楚。為此，本研究采用免疫組化方法結(jié)合激光共聚焦技術(shù)觀察

3、FOXO1在胰島的表達(dá)及細(xì)胞定位；通過病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和siRNA干預(yù)技術(shù)，在培養(yǎng)的大鼠胰腺癌β細(xì)胞系(INS-1E)中特異高表達(dá)組成性活性的FOXO1(FOXO1-AAA)或抑制其表達(dá)水平，觀察FOXO1表達(dá)水平的改變對(duì)β細(xì)胞增殖、凋亡的影響；進(jìn)一步采用基因芯片技術(shù)分析了INS-1E中受FOXO1調(diào)控的下游靶基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步的分析預(yù)測(cè)。具體的研究工作如下： 1.首先觀察了FOXO1在成年SD大鼠胰腺中的表達(dá)及分

4、布：4-6月成年SD大鼠胰腺進(jìn)行冰凍切片免疫組化分析，結(jié)果顯示FOXO1特異性表達(dá)在胰腺的胰島組織中。為了進(jìn)一步確定FOXO1在胰島組織中的細(xì)胞定位，采用免疫熒光標(biāo)記觀察不同熒光標(biāo)記的FOXO1(綠色)和胰島素(紅色)在胰島中的分布，激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)FOXO1蛋白與胰島素的定位一致(橙色)，表明FOXO1在生理情況下主要高表達(dá)在分泌胰島素的β細(xì)胞中。 2.為了闡明FOXO1在成熟胰島β細(xì)胞中的作用，我們首先構(gòu)建了高表達(dá)

5、FOXO1的腺病毒載體：利用基因同源重組原理，通過復(fù)制缺陷型pAdEasy腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建了磷酸化位點(diǎn)突變的具有組成活性的全長(zhǎng)FOXO1(T24A\S256A\S319A)重組腺病毒，純化后病毒滴度約為5×1012U/ml。病毒感染肝癌細(xì)胞系HepG2，通過觀察GFP熒光、Western blot等方法證明Ad-FOXO1-AAA重組腺病毒能有效的介導(dǎo)FOXO1蛋白的表達(dá)，經(jīng)灰度掃描及定量分析發(fā)現(xiàn)使FOXO1蛋白表達(dá)水平升高9.8倍。

6、 3.為了比較內(nèi)源性FOXO1蛋白表達(dá)水平降低對(duì)成熟β細(xì)胞功能的影響，我們構(gòu)建了針對(duì)FOXO1的siRNA腺病毒載體：利用WWW.ambion.com網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)，并輔助設(shè)計(jì)軟件，選擇了三個(gè)針對(duì)FOXO1的siRNA位點(diǎn)，分別為si-FOXO1-1、si-FOXO1-2和si-FOXO1-3；一個(gè)針對(duì)FOXO1和FOXO3同源序列的siRNA位點(diǎn)，命名為si-FOXO-pan；以及一個(gè)不針對(duì)任何基因的隨機(jī)序列作為陰性對(duì)照。人工合成s

7、i-FOXO1s的cDNA序列，退火形成的雙鏈cDNA克隆到腺病毒表達(dá)載體pAdTrack-CMV上，經(jīng)PmeI線性化后與pAdEasy-1細(xì)胞內(nèi)同源重組，最后在HEK293細(xì)胞中包裝為重組腺病毒，分別命名為Ad-si-FOXO1-1、Ad-si-FOXO1-2、Ad-si-FOXO1-3、Ad-si-FOXO-pan和Ad-NC。擴(kuò)增后測(cè)定病毒滴度均約為5×10122U/ml。重組腺病毒感染肝癌細(xì)胞系HepG2，Western blo

8、t檢測(cè)結(jié)果顯示，重組腺病毒能有效的抑制FOXO1蛋白的表達(dá)，經(jīng)灰度掃描及定量分析發(fā)現(xiàn)抑制效果達(dá)45-65％，其中si-FOXO1-3的抑制效果最顯著，達(dá)到65％。 4.為了確定FOXO1表達(dá)降低是否影響其轉(zhuǎn)錄功能，選取了FOXO1的靶基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)，檢測(cè)si-FOXO1s對(duì)其啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響：提取HepG2基因組DNA，PCR擴(kuò)增得到PEPCK基因長(zhǎng)約592bp的5’側(cè)翼區(qū)啟動(dòng)子序列，插入pGL3-

9、Basic熒光素報(bào)告質(zhì)粒中。加入Ad-si-FOXO1s重組腺病毒感染HepG2細(xì)胞后，檢測(cè)si-FOXO1s對(duì)PEPCK啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照si-NC相比，si-FOXO1s顯著降低PEPCK啟動(dòng)子的熒光素酶活性，其中Ad-si-FOXO1-1降低40％，Ad-si-FOXO1-2降低55％，Ad-si-FOXO1-3降低67％，Ad-si-FOXO-pan降低68％，表明構(gòu)建的Ad-si-FOXO1s能顯著抑制

10、FOXO1靶基因的表達(dá)，具有功能活性。si-FOXO1-3抑制蛋白表達(dá)最低，抑制后FOXO1的功能活性也最低，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇si-FOXO1-3。 5.為了觀察FOXO1表達(dá)水平的改變對(duì)胰島β細(xì)胞功能的影響，首先檢測(cè)si-FOXO1和FOXO1-AAA重組腺病毒能否有效的下調(diào)或上調(diào)胰腺癌β細(xì)胞系中FOXO1表達(dá)水平：將Ad-si-NC、Ad-si-FOXO1-3和Ad-FOXO1-AAA腺病毒感染胰腺癌β細(xì)胞系INS-1E，

11、發(fā)現(xiàn)有明顯綠色熒光表達(dá)，進(jìn)一步采用Western Blot分析各組細(xì)胞中FOXO1蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，經(jīng)掃描及定量分析發(fā)現(xiàn)Ad-si-FOXO1對(duì)FOXO1的表達(dá)抑制達(dá)74％，F(xiàn)OXO1-AAA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)使FOXO1表達(dá)升高8.7倍。 6.采用3H-TdR摻入實(shí)驗(yàn)觀察FOXO1表達(dá)水平的改變對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，降低FOXO1的表達(dá)顯著促進(jìn)了β細(xì)胞的增殖，而高表達(dá)FOXO1則顯著抑制了β細(xì)胞的增殖；與之相應(yīng)，MTT檢測(cè)

12、結(jié)果顯示，降低FOXO1的表達(dá)對(duì)β細(xì)胞存活有顯著促進(jìn)作用，高表達(dá)FOXO1對(duì)β細(xì)胞存活有顯著抑制作用；進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示降低FOXO1的表達(dá)使β細(xì)胞凋亡率降低，反之高表達(dá)FOXO1使β細(xì)胞凋亡率增加。采用放射免疫法檢測(cè)感染重組腺病毒后INS-1E細(xì)胞胰島素的分泌情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1表達(dá)水平的改變對(duì)胰腺癌β細(xì)胞系INS-1E的胰島素分泌沒有顯著影響。 7.為了深入揭示FOXO1在胰島β細(xì)胞中的作用

13、機(jī)制，我們進(jìn)一步采用基因芯片技術(shù)研究受FOXO1調(diào)節(jié)的下游靶基因表達(dá)變化情況：提取Ad-si-NC和Ad-FOXO1-AAA重組腺病毒感染的胰腺癌β細(xì)胞系INS-1E的總RNA，純化后制成cDNA探針，與Agilent大鼠全基因組芯片雜交，經(jīng)過信號(hào)檢測(cè)、微陣列圖像分析、計(jì)算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理，將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，篩選出差異表達(dá)基因。結(jié)果顯示，INS-1E細(xì)胞中高表達(dá)FOXO1與對(duì)照組有顯著差異(基因表達(dá)水平差異>2為顯著升高，<0.5為顯

14、著降低)的基因254條，其中表達(dá)序列標(biāo)簽(eXpressed sequence taq，EST)有107條，全長(zhǎng)基因有147個(gè)。表達(dá)上調(diào)的基因有135個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有12個(gè)。分析其功能后，從差異表達(dá)基因中初步篩選出參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡的基因16個(gè)。 本研究顯示在SD大鼠的胰島中，F(xiàn)OXO1主要高表達(dá)在分泌胰島素的胰島β細(xì)胞中；在培養(yǎng)的胰腺癌β細(xì)胞中初步證實(shí)，F(xiàn)OXO1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的變化對(duì)分化成熟的β細(xì)胞的增殖及凋亡具有