轉(zhuǎn)錄因子Twist 1在PPARγ介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵抗中的作用研究.pdf

1、研究目的:
　　流行病學(xué)研究表明，胰島素抵抗(IR)與糖尿病、高血壓、肥胖癥等多種代謝性疾病密切相關(guān)，是疾病發(fā)生的“共同土壤”。本課題旨在探討轉(zhuǎn)錄因子Twist1在脂肪細(xì)胞胰島素抵抗中的表達(dá)水平、對胰島素敏感性的影響以及其與過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的調(diào)控關(guān)系，明確Twist1基因在PPARγ介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞胰島素抵抗中的作用，為胰島素抵抗相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供相應(yīng)靶點(diǎn)。
　　研究方法:
　　1.臨床標(biāo)

2、本收集:選擇2016-2017年在山東省千佛山醫(yī)院進(jìn)行擇期手術(shù)的患者，按照體重指數(shù)(BMI)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)將研究對象分為對照組和肥胖型IR組。術(shù)中收取患者皮下脂肪組織，提取脂肪組織中的RNA，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄因子TWIST1和PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平。提取皮下脂肪組織中的蛋白，Western blot檢測分析轉(zhuǎn)錄因子TWIST1和PPARγ蛋白水平。
　　2.脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

3、及鑒定:體外培養(yǎng)3T3-L1脂肪前體細(xì)胞，一定方法誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，通過油紅O染色鑒定脂滴。應(yīng)用高糖/高胰島素誘導(dǎo)法建立脂肪細(xì)胞的IR模型，通過葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)、葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)鑒定IR模型。模型建立成功后提取脂肪細(xì)胞核蛋白，檢測Twist1和PPARγ在脂肪細(xì)胞IR模型中的蛋白表達(dá)水平。
　　3.轉(zhuǎn)錄因子Twist1的表達(dá)對胰島素敏感性的影響:慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染3T

4、3-L1成熟脂肪細(xì)胞，分別以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪細(xì)胞為對照，分析干擾和過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Twist1對脂肪細(xì)胞胰島素敏感性的影響。
　　4.轉(zhuǎn)錄因子Twist1的表達(dá)對脂肪細(xì)胞中PPARγ表達(dá)的影響:慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞，分別以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪細(xì)胞為對照，分析干擾和過表達(dá)Twist1對PPARγ表達(dá)的影響。
　　5.PPARγ表達(dá)變化對脂肪細(xì)胞中T

5、wist1的影響:PPARγ激動劑吡格列酮(0.1μmmol/L)和抑制劑T0070907(100μmmol/L)作用于誘導(dǎo)分化的成熟脂肪細(xì)胞，檢測PPARγ表達(dá)變化對Twist1表達(dá)的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1.以對照組皮下脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子TWIST1和PPARγ轉(zhuǎn)錄水平為100％，肥胖型IR組脂肪組織中TWIST1和PPARγ的轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)了41％和28％，具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　2.以對照

6、組患者的皮下脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子TWIST1和PPARγ的蛋白水平為100％，肥胖型IR組皮下脂肪組織中的TWIST1和PPARγ表達(dá)水平均顯著下調(diào)，半定量結(jié)果顯示TWIST1和PPARγ蛋白表達(dá)水平分別下調(diào)了26％和20％，下調(diào)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3.3T3-L1脂肪前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，油紅O染色顯示誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞漿內(nèi)聚集大量呈橘紅色的脂滴，而未被誘導(dǎo)分化的前體細(xì)胞油紅O染色未著色。以胰島

7、素未刺激狀態(tài)下葡萄糖消耗和攝取量為100％，對照組細(xì)胞的刺激組葡萄糖消耗是未刺激組的2倍，刺激組葡萄糖攝取量是未刺激組的3.1倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。高糖/高胰島素建立IR模型后，胰島素刺激組葡萄糖消耗是未刺激組的1.1倍，刺激組葡萄糖攝取量是未刺激組的1.3倍，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。但胰島素刺激狀態(tài)下的對照組細(xì)胞和IR組相比較，IR組細(xì)胞的葡萄糖消耗和葡萄糖攝取較對照組下調(diào)了46％和59％，存在顯著差異(P＜0.

8、05)。低濃度胰島素刺激建立的胰島素抵抗細(xì)胞模型，IR組脂肪細(xì)胞膜上的GLUT4免疫熒光強(qiáng)度明顯弱于對照組。提取脂肪細(xì)胞核蛋白，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)在3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型組中的轉(zhuǎn)錄因子Twist1和PPARγ蛋白表達(dá)水平是對照組的2.2倍及1.6倍，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3的脂肪細(xì)胞為對照，干擾Twist1后其相應(yīng)蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)了50％，半定量結(jié)果顯示下調(diào)

9、水平具有明顯差異(P＜0.05)。慢病毒轉(zhuǎn)染成熟脂肪細(xì)胞后建立IR模型，胰島素作用下的Twist1-/IR組脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取分別上調(diào)到NC-LV3/IR組的1.5倍和2倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色也顯示Twist1-/IR組細(xì)胞膜上的GLUT4分子數(shù)量較NC-LV3/IR組有增加。
　　5.以感染了陰性病毒顆粒NC-LV5的脂肪細(xì)胞為對照，過表達(dá)Twist1后其蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)了40％，半定

10、量結(jié)果顯示上調(diào)程度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。慢病毒轉(zhuǎn)染成熟脂肪細(xì)胞后建立IR模型，與NC-LV5/IR組細(xì)胞相比，胰島素作用后的Twist1+/IR組的葡萄糖消耗和葡萄糖攝取以及細(xì)胞膜上GLUT4熒光均無顯著差異，無顯著的統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05）。
　　6.分別以感染了陰性病毒顆粒NC-LV3和NC-LV5的脂肪細(xì)胞為對照，Twist1-組的3T3-L1成熟脂肪細(xì)胞中PPARγ蛋白表達(dá)水平較對照組下調(diào)36％，半定量分析下調(diào)程度

11、有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，Twist1+組PPARγ表達(dá)水平上調(diào)25％，半定量分析上調(diào)程度也有顯著差異（P＜0.05）。
　　7.PPARγ激動劑吡格列酮組與對照組比較，其Twist1蛋白表達(dá)水平上調(diào)，半定量顯示上調(diào)63％，上調(diào)程度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而抑制劑T0070907組相較于對照組，Twist1表達(dá)水平顯著下調(diào)了77％，半定量分析有明顯差異（P＜0.05）。
　　研究結(jié)論:
　　轉(zhuǎn)錄因子Twist