Apelin對(duì)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）是機(jī)體對(duì)胰島素的作用不敏感的一種病理狀態(tài)，是多種疾病的“共同土壤”。胰島素抵抗是代謝綜合征最核心的發(fā)病機(jī)制，它不僅可以導(dǎo)致2型糖尿病，還可以導(dǎo)致高血壓，血脂紊亂，動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管系統(tǒng)疾病。
　　Apelin是血管緊張素受體樣受體APJ的內(nèi)源性配體，主要由脂肪細(xì)胞分泌。Apelin及其受體APJ在全身多個(gè)系統(tǒng)，包括心血管，下丘腦，胃腸道，皮膚，肌肉

2、，乳腺和胎盤等，發(fā)揮著多種不同的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在新診斷的2型糖尿病病人中，apelin的水平是上升的，但是，在進(jìn)展期的2型糖尿病病人中，apelin的水平卻是降低的；另外，小鼠腹腔注射apelin后，在血糖下降的同時(shí)，血漿胰島素的水平也出現(xiàn)了下降，雖然其中的機(jī)制還未完全闡明，但是，這都提示我們，apelin和胰島素抵抗以及機(jī)體糖代謝密切相關(guān)。近期研究證實(shí)，在分離的胰島素抵抗骨骼肌細(xì)胞中，apelin能增加葡萄糖攝取。但是，ape

3、lin作為脂肪因子，其對(duì)脂肪細(xì)胞，特別是胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞的有何作用，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　研究目的：
　　1、Apelin對(duì)于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的作用。
　　2、Apelin對(duì)于胰島素敏感性的作用，以及對(duì)于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取的作用。
　　3、Apelin能否改善胰島素抵抗時(shí)低度炎癥狀態(tài)。
　　4、Apelin增加葡萄糖攝取，改善胰島素抵抗的可能機(jī)制。<

4、br>　　研究方法：
　　1、誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成為成熟脂肪細(xì)胞，并通過油紅O染色鑒定。
　　2、用TNF-α建立胰島素抵抗脂肪細(xì)胞模型，并通過葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)鑒定。
　　3、通過葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)觀察apelin對(duì)IR脂肪細(xì)胞糖攝取的作用，研究apelin是否能直接增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，是否能通過增加胰島素敏感性，間接增加葡萄糖攝取。
　　4、用過RT-PCR檢測(cè)相關(guān)炎癥因子m

5、RNA表達(dá)，通過western blotting分析相關(guān)信號(hào)通路蛋白表達(dá)，明確apelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞可能的機(jī)理。
　　5、通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）膜轉(zhuǎn)位，通過western blotting檢測(cè)GLUT4膜蛋白表達(dá)，明確GLUT4在apelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞接觸抑制后，通過地塞米松，異丁

6、基甲基黃嘌呤，胰島素混合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)8-12天，3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化成為成熟脂肪細(xì)胞。油紅O染色后證實(shí)85％以上3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。
　　2、在成熟的脂肪細(xì)胞中，10ng/mlTNF-α作用24h后，通過葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí)：TNF-α作用組脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素刺激的葡萄糖攝取降低47％（P<0.05），細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗。
　　3、通過不同劑量apelin（10nM，102nM，103nM，104nM）

7、apelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞60分鐘，及103nMapelin作用于胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞15分鐘，30分鐘，60分鐘，120分鐘，240分鐘，葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí)：apelin呈時(shí)間及濃度依賴型增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取(P<0.05 102nM apelin versus control; P<0.01 103nM apelin versus control)，(P<0.01 60mi

8、n versus control, P<0.05 120min versus control)，(P<0.05 103nM apelin versus 102nM apelin)。
　　4、通過葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí)：102nM及103nMapelin預(yù)處理60分鐘后，胰島素刺激的葡萄糖攝取顯著增加，103nMapelin對(duì)葡萄糖攝取具有更顯著的效應(yīng)。Apelin能增強(qiáng)胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性(P<0.05 10

9、2nM apelin versus insulin, P<0.01 103nM apelin versus insulin, P<0.05 103nM apelin versus 102nM apelin)。
　　5、在100nMPI3K/Akt的特異性抑制劑渥曼青霉素作用30分鐘后，apelin增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的作用顯著降低(P<0.05 versus 100 nM wort, P<0.01 vers

10、us 100 nM wort)。同時(shí)，通過Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)100nM渥曼青霉素作用30分鐘后，磷酸化Akt的水平降低。證實(shí)apelin增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取是通過PI3K/Akt通路。
　　6、通過細(xì)胞爬片后經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)證實(shí)：apelin增加葡萄糖攝取是通過促進(jìn)GLUT4從胞漿向胞膜轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)膜蛋白GLUT4也證實(shí)，apelin能增

11、加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞的GLUT4膜轉(zhuǎn)位。
　　7、提取細(xì)胞mRNA，經(jīng)RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)apelin能增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞抗炎因子adiponectin mRNA表達(dá)，降低炎癥因子IL-6mRNA表達(dá)(P<0.01 versus untreated)。Apelin能調(diào)節(jié)胰島素抵抗細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
　　結(jié)論：
　　1、Apelin呈時(shí)間及濃度依賴型增加胰島素抵抗3T3-L1脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝