S6K1在肝臟胰島素抵抗及脂肪肝中作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建S6K1shRNA重組基因腺病毒(S6K1Ax)并在細(xì)胞及小鼠水平驗(yàn)證對(duì)S6K1基因的沉默效果。將其注射到db/db小鼠尾靜脈內(nèi)，觀察肝臟S6K1基因沉默后對(duì)db/db小鼠肝臟胰島素抵抗及脂肪肝的影響并分析其作用機(jī)制。
　　 方法：設(shè)計(jì)3種S6K1shRNA基因序列，通過(guò)在pcPUR質(zhì)粒與pcDNA質(zhì)粒、cosmid質(zhì)粒之間的拼接將S6K1shRNA最后轉(zhuǎn)染進(jìn)腺病毒中，篩選出沉默效果最佳的重組基因腺病毒，并在293細(xì)胞

2、擴(kuò)增純化得到高效價(jià)的病毒。在western blot水平檢測(cè)S6K1Ax轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞AML12后S6K1蛋白表達(dá)，評(píng)價(jià)其基因沉默效果。將S6K1Ax注射進(jìn)C57BL/6J小鼠尾靜脈，用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot觀察小鼠肝臟S6K1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。將制備的S6K1Ax注射進(jìn)db/db小鼠尾靜脈，以注射pU6Ax的作為對(duì)照組，每組各6只，分別在第6日進(jìn)食及空腹?fàn)顟B(tài)時(shí)處死小鼠取肝臟，稱(chēng)取肝臟重

3、量，HE染色觀察肝臟形態(tài)，比色法測(cè)定肝臟甘油三酯含量。提取肝臟蛋白利用western blot方法檢測(cè)IRS1、IRS2及其酪氨酸蛋白的表達(dá)，提取肝臟總RNA用逆轉(zhuǎn)錄PCR法觀察糖異生基因PGC1α、PEPCK、G6Pase mRNA及脂肪酸代謝基因PPARα、CPT-1、SREBP1c、FAS、SCD-1mRNA表達(dá)。病毒注射前后尾靜脈取血測(cè)定血糖、胰島素、FFA、、TG、TC、ALT等，胰島素測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，F(xiàn)

4、FA、TG、CHO、ALT測(cè)定采用比色法。
　　 結(jié)果：制備的S6K1shRNA基因重組腺病毒可成功抑制小鼠AML12細(xì)胞的S6K1蛋白表達(dá)，將S6K1Ax注射進(jìn)C57BL/6J小鼠尾靜脈，第6日處死小鼠取肝臟提取肝臟蛋白，在S6K1蛋白表達(dá)被完全抑制的情況下，實(shí)驗(yàn)組mS6K154.7％表達(dá)被抑制(P<0.01)。與對(duì)照組相比，在進(jìn)食及空腹?fàn)顟B(tài)實(shí)驗(yàn)組IRS1、IRS2的蛋白表達(dá)均增強(qiáng)，但I(xiàn)RS1、IRS2酪氨酸磷酸化水平只有在空

5、腹時(shí)才較對(duì)照組表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)食狀態(tài)兩組沒(méi)有差異。逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示在空腹?fàn)顟B(tài)下S6K1Ax注射組糖異生基因PGC1α、PEPCK、G6Pase mRNA均表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。血清測(cè)定顯示空腹血糖S6K1Ax注射組呈下降趨勢(shì)，但未有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，無(wú)論空腹及進(jìn)食狀態(tài)血清胰島素水平與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，膽固醇均較對(duì)照組下降(P<0.01)，F(xiàn)FA在空腹S6K1Ax注射組表現(xiàn)了下降，谷

6、丙轉(zhuǎn)氨酶ALT在各組均沒(méi)有差異。與對(duì)照組相比，S6K1Ax注射組小鼠脂肪肝明顯改善，肝臟占體重百分比下降(P<0.01)，HE染色顯示S6K1Ax注射組小鼠肝臟細(xì)胞脂肪滴減少，肝臟甘油三酯含量降低，參與脂肪合成的基因mSREBP1c、mFAS、mSCD-1表達(dá)下降(P<0.01)，脂肪酸氧化基因mPPARα、CPT-1表達(dá)也降低(P<0.01)。
　　 結(jié)論：構(gòu)建的S6K1Ax可將小鼠肝細(xì)胞AML12細(xì)胞系及C57BL/6J小鼠