轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a在乙肝病毒復(fù)制中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【背景】
　　乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）相關(guān)性疾病仍然是當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病之一。全球大約有乙肝病毒攜帶者3.5－4億人。我國是乙肝的高發(fā)區(qū)，乙肝病毒攜帶者有1.2億之多，約占我國人口的9％。5年期間，約10－20％慢性肝炎患者可發(fā)展成肝硬化。6％－15％肝硬化和慢性肝炎患者可發(fā)展成肝癌。發(fā)生肝癌后的5年存活率不到5％。而目前的重組干擾素及核苷類似物等抗病毒治療手段由于持久效應(yīng)低下、副作用、耐藥等

2、導(dǎo)致療效不夠滿意，乙肝病毒復(fù)雜的復(fù)制調(diào)控過程阻礙著研究人員去尋找有效的治療途徑。因此，在探討乙肝病毒復(fù)制的分子機(jī)制基礎(chǔ)上尋找有效的治療靶點是目前研究的熱點。
　　現(xiàn)有研究顯示：雖然影響HBV復(fù)制的因素很多，如病毒自身編碼蛋白、細(xì)胞周期、免疫調(diào)節(jié)因子等，但是HBV基因組的轉(zhuǎn)錄是病毒復(fù)制過程中最關(guān)鍵的步驟，目前對HBV基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚缺乏整體認(rèn)識。已有研究表明：一些肝細(xì)胞富集轉(zhuǎn)錄因子如HNF1、HNF3、HNF4和C/EBP等在HB

3、V的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，但這些發(fā)現(xiàn)并未完全揭示HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制。這就提示，可能存在未知的調(diào)控HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)錄因子，以及這些已知和未知的轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在著相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，共同調(diào)控著HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。因此，尋找新的調(diào)控HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)錄因子并闡明它們的作用機(jī)制，對揭示HBV在體內(nèi)復(fù)制的分子機(jī)制和尋找新的抗病毒治療靶點具有重要意義。
　　【目的】
　　篩選調(diào)控乙肝病毒復(fù)制的新的轉(zhuǎn)錄因子，并探討這些轉(zhuǎn)錄因子在乙肝病

4、毒復(fù)制中的作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步闡明HBV在體內(nèi)復(fù)制的分子機(jī)制提供有益的補(bǔ)充，并為尋找新的抗病毒治療靶點提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.采用轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片檢測乙肝病毒穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15及其親本細(xì)胞HepG2轉(zhuǎn)錄因子活性譜的變化，對照注釋文件，找出活性差異的轉(zhuǎn)錄因子；
　　2.利用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA方法）對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證；
　　3.利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a

5、亞細(xì)胞定位；
　　4.用Western blot檢測細(xì)胞中的FoxO3a磷酸化水平；
　　5.收集患者乙肝病毒髙復(fù)制和低復(fù)制肝組織，Western blot檢測組織中FoxO3a磷酸化水平，分析FoxO3a的活性和HBV復(fù)制之間的關(guān)系；
　　6.構(gòu)建FoxO3a-siRNA表達(dá)載體，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，下調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中FoxO3a的表達(dá)；
　　7.通過實時熒光定量PCR檢測FoxO3a-siRNA對Hep

6、G2.2.15細(xì)胞中HBVDNA和mRNA水平的影響，ELISA檢測FoxO3a-siRNA對HbsAg和HbeAg蛋白水平的影響；
　　8.克隆HBV啟動子/增強(qiáng)子不同截短體，構(gòu)建含HBV啟動子/增強(qiáng)子序列的熒光素酶報告基因載體；報告基因?qū)嶒灆z測FoxO3a對HBV的轉(zhuǎn)錄活性的影響；
　　9.染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）方法驗證細(xì)胞內(nèi)FoxO3a與HBV啟動子或增強(qiáng)子的結(jié)合；
　　10.EMSA實驗確定HBV啟動子/

7、增強(qiáng)子中FoxO3a結(jié)合位點；
　　11.通過MTT試驗檢測FoxO3a-siRNA對肝癌細(xì)胞體外增殖能力的影響；
　　12.通過流式細(xì)胞術(shù)分析FoxO3a-siRNA對肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，Western blot檢測FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.在芯片注釋文件Matrix矩陣中查找轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片中表達(dá)差異點所對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，共篩選出12個轉(zhuǎn)錄因子

8、家族分子在乙肝病毒穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15和其親本細(xì)胞HepG2中活性差異明顯(＞1.5倍)，其中，在HepG2.2.15細(xì)胞中活性上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有：HNF(1,3,4)，C/EBP，F(xiàn)oxO(1,3a,4)，F(xiàn)OXI1，SF-1，GR，SRY，COUP-TF1；活性下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有AP1，AP2，SP(1,2,3,4)，Egr（1,2,3）；其中有5個家族分子尚未報道與HBV復(fù)制相關(guān)，它們分別是FoxO(1,3a,4)

9、，Egr（1,2,3），F(xiàn)OXI1，SRY，AP2；在這5個家族分子中，以FoxO(1,3a,4)家族和AP2家族活性差異最為明顯；
　　2.ELISA結(jié)果顯示：與對照細(xì)胞HepG2相比，F(xiàn)oxO(1,3a,4)在HepG2.2.15細(xì)胞中活性明顯上調(diào)；而AP2在HepG2.2.15細(xì)胞中活性明顯下調(diào)，與芯片結(jié)果一致；
　　3.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞，F(xiàn)oxO3a主要定位細(xì)胞漿，而在HepG2.2.15細(xì)

10、胞，F(xiàn)oxO3a主要定位細(xì)胞核；
　　4.Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO3a的磷酸化蛋白水平在HepG2細(xì)胞明顯呈高表達(dá)，而在HepG2.2.15呈低表達(dá)，p<0.05，具有統(tǒng)計學(xué)意義；
　　5.Western blot檢測組織標(biāo)本中FoxO3a的磷酸化蛋白水平，結(jié)果表明：在7例HBV高復(fù)制的肝組織中FoxO3a磷酸化水平顯著低于6例低復(fù)制肝組織；
　　6.將FoxO3a-siRNA表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染HepG

11、2.2.15細(xì)胞，Westernblot結(jié)果證實，F(xiàn)oxO3a-siRNA能顯著降低FoxO3a的表達(dá)；
　　7.實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)oxO3a-siRNA能顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞上清和細(xì)胞內(nèi)的HBVDNA的水平；
　　8.實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示FoxO3a-siRNA能顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞的HBVmRNA的水平；
　　9.ELISA的結(jié)果表明：FoxO3a-siRNA能顯著

12、抑制乙肝病毒HBsAg和HBeAg蛋白水平，并且具有時間依賴性；
　　10.通過生物信息學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在HBV的啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域有4個潛在的FREs（FoxO3a的DNA結(jié)合序列：(G/C)(T/A)AA(C/T)AA），將其成功亞克隆入報告基因載體，雙熒光素報告基因結(jié)果表明：
　　1）FoxO3a可以直接調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄活性；
　　2）FoxO3a調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄活性的潛在FRE位于FRE1(HBV基因組955

13、－1184的區(qū)域內(nèi))；
　　11.CHIP實驗進(jìn)一步證實在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)FoxO3a同樣可與HBV增強(qiáng)子的結(jié)合，結(jié)合區(qū)域同報告基因結(jié)果(HBV基因組955－1184的區(qū)域內(nèi))；
　　12.EMSA結(jié)果證實FoxO3a通過與HBV增強(qiáng)子Ⅰ序列1127－1134bp（5’-GTAAACAA-3’）位點結(jié)合，增加HBV增強(qiáng)子Ⅰ的活性；
　　13.流式細(xì)胞術(shù)檢測周期發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3a-siRNA導(dǎo)致HepG2.2.

14、15細(xì)胞周期進(jìn)展，Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)oxO3a上調(diào)P27KIP1的表達(dá)，而下調(diào)cyclinD1和cyclinD2的表達(dá)；
　　14.生長曲線實驗表明，F(xiàn)oxO3a-siRNA能促進(jìn)肝癌細(xì)胞體外增殖能力。
　　【結(jié)論】
　　1.宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在乙肝病毒穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系和其親本細(xì)胞中存在活性差異，眾多已知和未知的轉(zhuǎn)錄因子可能參與乙肝病毒的復(fù)制；
　　2.FoxO3a在乙肝病毒感染的細(xì)胞和組織中