缺氧脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基造成骨骼肌細(xì)胞胰島素抵抗.pdf

1、研究目的:
　　 脂肪組織缺氧是肥胖的早期表現(xiàn)，與巨噬細(xì)胞浸潤和局部炎癥相關(guān)。我們研究在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞，釋放促炎因子對巨噬細(xì)胞遷移以及骨骼肌胰島素作用的影響。
　　 方法:
　　 1.在21％ O2，5％CO2（常氧）或1％ O2，94％ N2，5％ CO2（缺氧）培箱中培養(yǎng)脂肪細(xì)胞，并提取條件培養(yǎng)基。
　　 2.Real-time PCR測定缺氧脂肪細(xì)胞的脂肪因子的mRNA水平。
　　

2、 3.ELISA測定脂肪細(xì)胞條件培養(yǎng)基CM-H中TNFa、IL-6、MCP-1和脂聯(lián)素的水平。
　　 4.Transwell系統(tǒng)觀察缺氧培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的趨化作用。
　　 5.偶聯(lián)抗體的吸光度分析法測定骨骼肌中GLUT4轉(zhuǎn)位。
　　 6.Western Blot法測定胰島素信號分子的磷酸化水平。
　　 7.熱滅活CM-H后檢測對骨骼肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位的影響。
　　 8.中和抗體中和CM-

3、H中MCP-1、IL-6后檢測對骨骼肌細(xì)胞作用的影響。
　　 9.加入AMPK抑制劑Compound C后檢測其對骨骼肌細(xì)胞作用的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.3T3-L1脂肪細(xì)胞缺氧后缺氧誘導(dǎo)因子HIF1α和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT1的蛋白表達(dá)升高。
　　 2.缺氧脂肪細(xì)胞的TNEα， IL-6和MCP-1的mRNA表達(dá)增加，而脂聯(lián)素的mRNA表達(dá)降低。
　　 3.CM-H中的TNFαL，IL-6

4、和MCP-1濃度增加，而脂聯(lián)素濃度降低。
　　 4.在Transwell的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，缺氧脂肪細(xì)胞比常氧脂肪細(xì)胞募集更多巨噬細(xì)胞。用中和抗體中和共培養(yǎng)系統(tǒng)中的MCP-1抑制巨噬細(xì)胞的遷移。
　　 5.CM-H導(dǎo)致C2C12肌管基礎(chǔ)狀態(tài)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT4轉(zhuǎn)位增加而胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位減少。
　　 6.CM-H導(dǎo)致C2C12肌管中介導(dǎo)胰島素調(diào)節(jié)的GLUT4外排的兩個關(guān)鍵信號分子Akt和AS160磷酸化水平

5、明顯降低。CM-H磷酸化JNK和S6K，并增加 C2C12肌管細(xì)胞的IRS1絲氨酸磷酸化水平。
　　 7.熱滅活CM-H中的細(xì)胞因子逆轉(zhuǎn)其對肌細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位的影響。
　　 8.在CM-H中加入IL-6中和抗體，部分逆轉(zhuǎn)條件培養(yǎng)基造成的骨骼肌細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)GLUT4轉(zhuǎn)位及胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位增加。
　　 9.在CM-H中加入AMPK抑制劑Compound C，部分逆轉(zhuǎn)條件培養(yǎng)基對骨骼肌細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)GLUT4

6、轉(zhuǎn)位及胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位增加。
　　 10.在CM-H中加入MCP-1中和抗體，部分逆轉(zhuǎn)條件培養(yǎng)基造成的骨骼肌細(xì)胞胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位減少。
　　 結(jié)論:
　　 1.缺氧可以使脂肪細(xì)胞TNFα，IL-6和MCP-1表達(dá)與分泌增加，脂聯(lián)素的表達(dá)與分泌降低。
　　 2.升高的趨化因子MCP-1可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向脂肪細(xì)胞遷移。
　　 3.CM-H造成骨骼肌細(xì)胞膜上基礎(chǔ)狀態(tài)GLUT4轉(zhuǎn)位增加