人骨骼肌成肌細(xì)胞的分離培養(yǎng).pdf

1、由于心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不能再生，而且心臟內(nèi)沒(méi)有心肌干細(xì)胞，因此心肌細(xì)胞損傷后只能通過(guò)瘢痕組織來(lái)修復(fù)，大量有收縮功能的細(xì)胞流失必然造成心室重構(gòu)和心功能降低，最后導(dǎo)致患者終末期心力衰竭(chronicheartfailure，CHF)，死亡。目前治療心衰的方法很多，包括藥物、PTCA支架置入術(shù)和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)、心臟移植及基因治療等，可通過(guò)降低心肌耗氧量、增加心肌血供、增強(qiáng)心肌收縮力及減輕心室重構(gòu)等方法一定程度上延長(zhǎng)患者

2、生存期，但均不能從根本上解決心肌丟失的問(wèn)題，不能逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，使治療效果受到限制。近年來(lái)，利用細(xì)胞移植的方法重塑壞死區(qū)的心肌結(jié)構(gòu)受到廣泛的關(guān)注，但由于供體的匱乏和異體移植帶來(lái)的排斥反應(yīng)，使胚胎心肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或成體干/祖細(xì)胞受到很大限制。而骨骼肌成肌細(xì)胞可自體移植，不受供體來(lái)源限制，不需免疫抑制，故備受關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)旨在探索高效的人骨骼肌成肌細(xì)胞分離培養(yǎng)方法，為臨床應(yīng)用自體成肌細(xì)胞移植治療心衰打下良好基礎(chǔ)。 方法：1.采用組織

3、塊反復(fù)貼壁法原代培養(yǎng)人骨骼肌成肌細(xì)胞，觀察成肌細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)變化；2.利用骨骼肌特異性標(biāo)記物肌動(dòng)蛋白(Actin)及結(jié)蛋白(desmin)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定；3.將原代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞多次傳代，同時(shí)對(duì)原代及傳代培養(yǎng)的成肌細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制其生長(zhǎng)曲線，觀察成肌細(xì)胞增殖分化特性；4.探索成肌細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的方法。 結(jié)果：1.形態(tài)學(xué)觀察：采用組織塊貼壁培養(yǎng)法，肌組織塊接種于培養(yǎng)瓶5天后可見(jiàn)長(zhǎng)梭形、紡錘形單核成肌細(xì)胞緩慢向組織塊外生

4、長(zhǎng)，第6天后單核雙極性成肌細(xì)胞向組織塊外大量擴(kuò)展呈鋪開(kāi)狀放射樣分布，生長(zhǎng)迅速，遠(yuǎn)離組織塊區(qū)域的成肌細(xì)胞可呈典型的克隆樣生長(zhǎng)和簇狀分布，表現(xiàn)出很強(qiáng)的分裂增殖生長(zhǎng)特性。8-10天后，大量增殖的成肌細(xì)胞相互融合，形成核位于中央的多核性長(zhǎng)管狀初生肌管。因此上述原代培養(yǎng)的肌細(xì)胞成肌過(guò)程大致分為緩慢生長(zhǎng)期、分裂增殖期及肌管形成期3個(gè)不同的生長(zhǎng)增殖分化期，時(shí)間分別為培養(yǎng)的第1-5天、6-8天、8-10天。在保持適宜的細(xì)胞密度和細(xì)胞培養(yǎng)條件下，組織塊至

5、少可以反復(fù)貼壁12次，而細(xì)胞形態(tài)保持不變。2.免疫組織化學(xué)鑒定：骨骼肌特異性標(biāo)記物肌動(dòng)蛋白(Actin)和結(jié)蛋白(desmin)免疫組化鑒定為陽(yáng)性，證實(shí)了培養(yǎng)細(xì)胞的骨骼肌來(lái)源。3.骨骼肌成肌細(xì)胞增殖分化特性：采用組織塊反復(fù)貼壁培養(yǎng)法，肌組織塊貼壁后5天即開(kāi)始有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，6-8天時(shí)生長(zhǎng)旺盛，10天時(shí)長(zhǎng)滿瓶底，可達(dá)1.6×104/cm2；原代培養(yǎng)細(xì)胞共貼壁12次，隨著貼壁次數(shù)增多，細(xì)胞爬出的速度增快，約在第10次時(shí)最快，3天即可

6、見(jiàn)有細(xì)胞爬出。原代培養(yǎng)的細(xì)胞至少可以傳代20次以上，在第10-15代時(shí)細(xì)胞增殖最為迅速，細(xì)胞倍增時(shí)間為24小時(shí)。4.凍存與復(fù)蘇：成肌細(xì)胞凍存、復(fù)蘇后生長(zhǎng)良好，仍可保持原有形態(tài)及增殖分化特性。 結(jié)論：與酶消化法相比，組織塊貼壁法簡(jiǎn)便、可行，耗材少，時(shí)間短、成本低。該方法實(shí)用性強(qiáng)，可在短時(shí)間內(nèi)得到大量的高純度的成肌細(xì)胞，是原代培養(yǎng)人骨骼肌成肌細(xì)胞的較好方法。同時(shí)，可通過(guò)適當(dāng)?shù)膬龃婕皬?fù)蘇方法使培養(yǎng)細(xì)胞得以長(zhǎng)時(shí)間保存，為適時(shí)臨床細(xì)胞移植