魯西黃牛胚胎骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells，SCs）最早由Mauro在蛙脛前肌中發(fā)現(xiàn)，具有較強(qiáng)的自我更新、增殖和多向分化潛能，在體外培養(yǎng)條件下能跨胚層分化為多種細(xì)胞類(lèi)型。魯西黃牛是世界上著名的肉用牛，已列入國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源重點(diǎn)保護(hù)品種名錄。本研究旨在建立魯西黃牛胚胎骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系，并探索其低、中、高代次細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)特性，結(jié)論如下：
　?。?）本研究選取魯西黃牛四肢骨骼肌，采用機(jī)械分離法、聯(lián)合酶消化法

2、及差速貼壁法，成功分離獲得牛SCs，優(yōu)化了牛SCs體外擴(kuò)增的最佳培養(yǎng)體系，并將牛SCs成功傳至23代，凍存后牛SCs仍具有較高的細(xì)胞活率。
　　（2）免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)牛SCs標(biāo)志物表達(dá)，結(jié)果顯示，P4、P9、P20代牛SCs均為Desmin、MyoD陽(yáng)性表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)牛SCs標(biāo)志物表達(dá)，結(jié)果顯示P4、P9、P20代牛SCs均為Desmin、Pax7、c-Met、Myf5陽(yáng)性表達(dá)，且灰度分析結(jié)果顯示，不同代次SCs同一標(biāo)

3、志物表達(dá)量差異不顯著，符合SCs標(biāo)志物表達(dá)情況。
　　（3）P4、P9、P20代牛 SCs生長(zhǎng)曲線均呈標(biāo)準(zhǔn)“S”型，分別經(jīng)歷了潛伏期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期；不同代次SCs均具有較高的克隆形成能力，但克隆形成率隨著細(xì)胞代次增加而降低；流式細(xì)胞儀分析SCs細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞代次的增加， G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例下降。
　　（4）牛SCs染色體數(shù)目為2n=60，且染色體形態(tài)無(wú)畸變，除性染色體外，均為端著絲粒染

4、色體，表明本試驗(yàn)分離獲得的SCs均來(lái)自正常的魯西黃牛胚胎個(gè)體。
　?。?）在不同的體外誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)P4、P9、P20代牛SCs向成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和表皮細(xì)胞分化。應(yīng)用相應(yīng)的染色方法檢測(cè)誘導(dǎo)效果，結(jié)果顯示，不同染色方法均呈陽(yáng)性表達(dá)；RT-PCR檢測(cè) SCs向不同細(xì)胞誘導(dǎo)后相應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)，包括成肌細(xì)胞標(biāo)志物fast skeletal myosin，脂肪細(xì)胞標(biāo)志物PPARγ、LPL，成骨細(xì)胞標(biāo)志物osteopo

5、ntin、Collage typeⅠ，神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2、nestin和表皮細(xì)胞標(biāo)志物α6和 CK19，結(jié)果顯示，所有標(biāo)志物均呈陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)目的基因表達(dá)量進(jìn)行灰度分析發(fā)現(xiàn)，中、低代次SCs分化能力無(wú)顯著差異，高代次SCs的分化能力顯著降低。
　　實(shí)驗(yàn)證明，魯西黃牛胚胎SCs適合在體外分離培養(yǎng)，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)后，低、中、高代次SCs仍具有較強(qiáng)的自我更新、增殖和分化等生物學(xué)特性，且具有取材方便，獲得細(xì)胞數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種理想的