體外三維培養(yǎng)成肌干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、骨骼肌組織工程的醫(yī)學(xué)介入,在改善移植細(xì)胞的質(zhì)量和生存方面擁有巨大潛力。目前在骨骼肌三維培養(yǎng)、體外大塊組織構(gòu)建等方面面臨巨大的挑戰(zhàn),使各種因為造成的失骨骼肌組織功能的重建缺乏功能性組織代用品而受阻。運(yùn)用組織工程替代品體內(nèi)修復(fù)缺失的肌肉功能是有困難的:1、再建肌肉組織需要具有天然組織結(jié)構(gòu)和充分的再生能力；2、組織結(jié)構(gòu)進(jìn)入宿主后缺乏活力和相容性。許多學(xué)者在骨骼肌的體外構(gòu)建和替代研究方面做了大量研究,試圖創(chuàng)建功能化的肌組織:Dennis和Kos

2、nik等[1,2]探索出三維骨骼肌組織的自組裝模式,將成肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共培養(yǎng),由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)并包裹形成肌管,橫向電刺激時產(chǎn)生持續(xù)的興奮和收縮；德國的Bach[3,4]鍆研究組進(jìn)行了成肌細(xì)胞與纖維蛋白三維支架的復(fù)合培養(yǎng),獲得具有極性分化功能的多核肌管；Sxena采用聚乙醇酸網(wǎng)與成肌細(xì)胞復(fù)合并進(jìn)行體內(nèi)移植,獲得血管化的骨骼肌樣組織。盡管國外學(xué)者已涉及骨骼肌組織工程三維構(gòu)建研究,但都處于初級摸索階段,國內(nèi)目前尚沒有體外骨骼肌三

3、維構(gòu)建的文獻(xiàn)報道。鑒于國內(nèi)外現(xiàn)狀,我們實驗組在體外三維骨骼肌的構(gòu)建方面進(jìn)行初步的探索。眾所周知,骨骼肌組織工程包括三要素,即干細(xì)胞、支架、生長因子。細(xì)胞與支架材料的相互作用是組織工程研究的主要領(lǐng)域,其目的是使細(xì)胞能在基質(zhì)材料上貼附和正常生長。體外條件下,能否獲取極性、平行排列的分化肌管,是三維肌組織構(gòu)建成功的關(guān)鍵,因為肌纖維的平行排列特性,是肌組織發(fā)揮收縮功能的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。我們實驗組運(yùn)用修飾后的硅酮彈性體作為三維支架與C2C12細(xì)胞共培

4、養(yǎng)獲取極性肌管。硅酮彈性體(Sylgard 184)有柔性基底層特征,表面光滑并具有一定的彈性,便于檢測細(xì)胞移動和加載產(chǎn)生的牽拉力[5]。
　　 前期的實驗篩選了sylgard 184支架修飾包被的最佳基質(zhì)材料,使成肌細(xì)胞與基質(zhì)材料具良好相容性；并掌握細(xì)胞在材料表面的增殖、分化特性,初步探索了體外構(gòu)建肌組織的可能性。在此基礎(chǔ)上我們將進(jìn)一步完善骨骼肌的體外三維構(gòu)建,優(yōu)化極性平行肌管培養(yǎng)方法,改善Sylgard 184鑄槽技術(shù)。通過

5、修飾后的鑄槽對分化期C2C12細(xì)胞的極性誘導(dǎo)、促分化、促延展作用,獲取高密度、極性分化、具備收縮蛋白和生肌轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)能力的肌管,使其結(jié)構(gòu)更接近在體生理狀態(tài),并檢測分析Sylgard 184三維基質(zhì)材料對成肌干細(xì)胞生長分化的影響。為更優(yōu)化體外肌組織類似物的構(gòu)建,我們嘗試應(yīng)用具良好生物相容性、降解特性、在組織工程研究領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用的生物支架材料PGA與C2C12進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng),探討體外相容性和構(gòu)建的可行性。同時進(jìn)行三維和傳統(tǒng)平面培養(yǎng)兩種不

6、同的培養(yǎng)方法獲取肌管,檢測成肌轉(zhuǎn)錄因子和生肌標(biāo)志蛋白表達(dá),從成肌特性、收縮功能等方面進(jìn)行分析,比較研究三維與平面培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)及功能差異,為下一步的三維肌組織構(gòu)建和應(yīng)力拉伸研究提供理論和技術(shù)支持。這種體外培養(yǎng)三維極性肌管成分比較單一,可以避免其他因素的干擾,是研究肌細(xì)胞和肌組織自身功能活性的良好模型,有助于我們了解細(xì)胞發(fā)育中的一些基本原理。所構(gòu)建的肌組織模型進(jìn)一步研究有望能夠替代體外骨骼肌組織,加載相應(yīng)處理因素,為各種肌病的病因研究模擬病

7、理學(xué)條件。
　　 我們的主要研究內(nèi)容
　　 第一章硅酮彈性體(sylgard 184)三維基質(zhì)材料對成肌干細(xì)胞生長分化的影響
　　 [目的]
　　 鑄型并修飾的Sylgard 184與C2C12細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)獲取三維極性肌管并檢測分析硅酮彈性體三維基質(zhì)材料對成肌干細(xì)胞生長分化的影響。
　　 [方法]
　　 sylgard 184雙組分以10:1的比例均勻混合,倒入6孔板中,半固化時對Sylg

8、ard 184表面進(jìn)行壓痕鑄型,每條鑄槽長25ram,寬0.8mm,深1mm,置生物安全柜完全固化,Matrigel和膠原混合液均勻鋪被凹槽底部,紫外線照射備用。接種密度為1x106/ml的C2C12細(xì)胞懸液,細(xì)胞融合80％時,加入含2％馬血清的DMEM/F12分化培養(yǎng)以獲取極性肌管。倒置顯微鏡、HE染色觀察肌管的分化狀態(tài)及結(jié)構(gòu),RT-PCR、免疫熒光檢測。
　　 [結(jié)果]
　　 Sylgard 184凹槽表面生長的C2

9、C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化10d后,鏡下可見融合為多核、極性生長的肌管；20d時可見肌管明顯增粗、成熟、極性平行分布,相互融合形成肌組織類似物,有自主收縮性。HE染色可見平行的肌管內(nèi)有大量細(xì)胞核存在,PCR檢測到MyoD、Myogenin mRNA陽性表達(dá)；免疫熒光實驗檢測極性肌管內(nèi)分化特異性標(biāo)志蛋白Myogenin、成肌特異性蛋白F-actin、MHC表達(dá)密集,表明構(gòu)建的肌組織類似物有成肌特征和收縮性。
　　 [結(jié)論]
　　

10、鑄型的Sylgard 184凹槽具有一定的方向引導(dǎo)效應(yīng),復(fù)合培養(yǎng)C2C12細(xì)胞,能誘導(dǎo)分化形成多核、重疊、極性肌管。實驗表明,經(jīng)修飾的Sylgard 184三維支架為成肌干細(xì)胞提供賴以寄宿、增殖和分化的場所,具有良好的生物相容性,能增進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖,引導(dǎo)多核肌管極性生長,促進(jìn)肌樣分化,誘導(dǎo)組織再生,所獲得的骨骼肌組織類似物具有肌組織的生物學(xué)特性,其結(jié)構(gòu)更接近在體生理狀態(tài)。為下一步成功構(gòu)建較大體積的體外三維肌組織模型奠定基礎(chǔ)。

11、　　 第二章聚羥基乙酸(PGA)與成肌干細(xì)胞的體外相容性研究
　　 [目的]
　　 觀察成肌干細(xì)胞在聚羥基乙酸(PGA)上的粘附生長情況及在體外形成肌組織類似物的能力。
　　 [方法]
　　 將松散的PGA纖維纏繞固定在蓋玻片表面,確保纖維的平行排列和維持一定的張力。PGA纖維束長3cm,直徑約0.2cm。碘酒、乙醇浸泡消毒,0.1％PBS沖洗,Ⅰ型膠原和Matrigel混合物包被,紫外線消毒30min

12、。加入含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,置37℃5％CO2孵箱預(yù)培養(yǎng)3d。接種C2C12細(xì)胞濃懸液,與PGA材料進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)、分化,掃描電鏡下觀察C2C12細(xì)胞與PGA的粘附生長情況。
　　 [結(jié)果]
　　 PGA纖維束接種C2C12細(xì)胞后,倒置顯微鏡下可見細(xì)胞生長狀態(tài)良好,均勻粘附于纖維表面及空隙中,細(xì)胞橢圓至梭形,沿PGA纖維縱軸方向向兩極伸展,與材料相容良好,PGA纖維與貼壁生長的細(xì)胞之間無間隙和距離。分化培

13、養(yǎng)7d后,對分化形成的肌組織類似物行掃描電鏡,可見PGA纖維表面有較多的貼附生長的成肌細(xì)胞,肌管沿PGA平行排列方向生長,融合形成膜狀結(jié)構(gòu),細(xì)胞基質(zhì)分泌旺盛,肌管的分化不均一,長短、直徑不一致,分化肌管存活良好。成肌干細(xì)胞與PGA纖維有較好的生物相容性。
　　 [結(jié)論]
　　 PGA是目前應(yīng)用最為廣泛的組織工程支架材料,其良好的生物相容性、降解特性和體內(nèi)良好歸宿,獲得組織工程研究者的青睞。由于PGA纖維能夠平行排列成束,

14、有極性誘導(dǎo)效應(yīng),且細(xì)胞懸液易于滲透,有利于成肌干細(xì)胞的體外生長和極性分化。掃描電鏡初步證實了成肌細(xì)胞在PGA表面的良好生物相容性和極性分化潛能,肌管極性生長,融合成肌膜狀結(jié)構(gòu),表明PGA纖維作為支架材料用于體外肌組織構(gòu)建的可行性。
　　 第三章成肌干細(xì)胞體外三維及平面培養(yǎng)的比較研究
　　 [目的]
　　 比較三維與平面培養(yǎng)C2C12細(xì)胞形態(tài)及功能差異。
　　 [方法]
　　 Ⅰ型膠原和Matrig

15、el Matrix修飾Sylgard 184鑄槽和普通培養(yǎng)皿,分別接種C2C12細(xì)胞懸液,細(xì)胞增殖至80％融合時,換含2％馬血清的DMEM/F12誘導(dǎo)分化獲取成熟的肌管；倒置顯微鏡觀察肌管形態(tài),RT-PCR方法檢測MyoD、Myogenin基因mRNA的表達(dá),免疫熒光檢測成肌特異性蛋白MyoD、Myogenin、Desmin、F-actin、MHC和nAChR等的表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 Sylgard 184鑄槽表

16、面的C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化5d,倒置顯微鏡下可見肌管融合多核、極性生長趨勢；17d后肌管增粗成熟、極性平行,融合形成肌組織類似物,有自主收縮性；掃描電鏡見肌管之間排列緊密、重疊,厚0.3mm,具有三維性；而平面培養(yǎng)分化3d后倒置顯微鏡下可見肌管融合,分化7d達(dá)成熟峰值,肌管小而排列紊亂。RT-PCR檢測三維和平面培養(yǎng)MyoD、Myogenin mRNA均陽性表達(dá),但三維培養(yǎng)的表達(dá)更強(qiáng)；MyoD、Myogenin、Desmin、F-act

17、in、MHC和nAChR等特異性蛋白檢測顯示,極性肌管內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)更密集。
　　 [結(jié)論]
　　 相對于傳統(tǒng)的平面培養(yǎng),三維極性肌管的生存時間、功能表達(dá)、肌管間的細(xì)胞連接更加優(yōu)化。三維培養(yǎng)有較高的細(xì)胞成活率、肌管呈極性平行分布特征,有利于成肌細(xì)胞的體外極性分化和肌管間細(xì)胞連接的形成,肌管存活時間長且一管多核,有利于成肌分化因子和收縮蛋白的表達(dá),其結(jié)構(gòu)更接近其生理狀態(tài),且無其他細(xì)胞或組織成分的干擾,肌管純度高并具備自主