胎盤(pán)來(lái)源多能細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的:間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem eells，MSCs)具有高度增殖、自我更新的能力，廣泛分布于多種人體組織中，參與機(jī)體組織器官的正常功能活動(dòng)和損傷修復(fù)，是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。目前已成功地從人骨髓、外周血、肌肉、脂肪、臍血、羊水及胎兒組織中分離并鑒定出MSCs。其中骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)研究最多，也取得了一些進(jìn)展。但也發(fā)現(xiàn)臨床采集骨髓

2、有一定困難，可能感染并引起并發(fā)癥，而且隨著供者年齡增加其數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降。近幾年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)組織中存在MSCs。與骨髓取材相比胎盤(pán)在胎兒娩出后即完成使命，成為“廢棄”物，其取材方便，易于分離，對(duì)其研究不會(huì)涉及倫理道德問(wèn)題，因而可能成為組織修復(fù)和基因治療的新細(xì)胞來(lái)源。本課題旨在探索體外分離培養(yǎng)胎盤(pán)來(lái)源多能細(xì)胞(placenta-deftved mutipotent cells,PDMCs)的方法和條件，以及對(duì)其生物學(xué)和功

3、能上的特性進(jìn)行初步研究。 對(duì)象和方法: (1)胎盤(pán)組織30份:在無(wú)菌條件下，采集足月健康順產(chǎn)分娩孕婦的胎盤(pán)。 (2)PDMCs的制備：剪切胎盤(pán)蛻膜組織1~2mm<'3>。大小的組織塊，用酶消化法從中分離得到細(xì)胞懸液，通過(guò)人淋巴分離液密度梯度離心得到單核細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中。 (3)取原代到15代細(xì)胞分別利用MTT染色技術(shù)，免疫組織化學(xué)染色，HE染色，透射電鏡，以及流式細(xì)胞檢測(cè)儀，從不同層面和角度鑒定胎盤(pán)來(lái)

4、源多能細(xì)胞的生物學(xué)特征，并與BMSCs進(jìn)行對(duì)比研究，以觀察兩者之間在生物學(xué)特性方面的異同。 結(jié)果: (1)細(xì)胞培養(yǎng)：通過(guò)混合酶消化法可以得到PDMCs，細(xì)胞形態(tài)良好，傳至15代沒(méi)有形態(tài)改變。 (2)細(xì)胞形態(tài)：通過(guò)倒置顯微鏡和HE染色觀察可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，漩渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞體積較大。 (3)細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律：原代細(xì)胞接種后的9～14天出現(xiàn)細(xì)胞克隆。傳代之后的第4天為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此后到第7天為平穩(wěn)期。14天左右為衰

5、退期。與文獻(xiàn)報(bào)道的來(lái)自于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律類(lèi)似。 (4)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：通過(guò)透射電鏡觀察PDMCs和BMSCs，發(fā)現(xiàn)兩者有共同的特點(diǎn)，即核膜不規(guī)則，核仁明顯，核內(nèi)以常染色質(zhì)為主，且分布均勻；胞漿內(nèi)，可見(jiàn)豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體，核糖體等細(xì)胞器，并且胞膜完整，表面有大量微絨毛。 (5)表面標(biāo)志：通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和流式細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PDMCs表達(dá)CD105，CD166，CD44，CD29，CD9，HLA-ABC，