大鼠脂肪來源血管內皮細胞的改良式培養(yǎng)與生物學特性的初步研究.pdf

1、目的:
　　基于目前各種血管內皮細胞(vascularendothelialcells,VECs)的培養(yǎng)方法還存在一些問題,如取材困難、操作復雜、周期長、細胞量小、不能反復傳代、經(jīng)濟成本高等。本研究通過對傳統(tǒng)酶消化法獲取血管內皮細胞的方法進行改良,探討此方法可以解決傳統(tǒng)方法的部分問題,并初步研究VECs的生物學特性,還對與VECs具有協(xié)同作用的脂肪來源干細胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)進行了基礎

2、研究,為后續(xù)脂肪移植血管化與脂肪組織工程血管化研究篩選性能良好的種子細胞奠定一定的細胞基礎。
　　方法:
　　1.脂肪來源血管內皮細胞的初步提取:采用膠原酶消化SD大鼠睪丸囊脂肪組織,以改良式方法(去除脂肪筋膜組織、保留微血管、減少膠原酶消化時間)初步獲取脂肪來源血管內皮細胞。
　　2.細胞的純化與擴增:通過酶消化法人工純化、擴增血管內皮細胞。
　　3.生物學特性檢測:通過倒置顯微鏡觀察凍存前與復蘇后(凍存于液氮

3、中12個月)的P3及P15代VECs細胞后觀察細胞形態(tài)及貼壁時間有無明顯差異;采用MTT比色法檢測細胞的增殖狀況。
　　4.鑒定:流式細胞儀(FCM)檢測細胞表面標志物CD31、CD29及第Ⅷ因子相關抗原,以明確分離培養(yǎng)的細胞為VECs。
　　5.活體移植:將血管內皮細胞混懸液局部皮內注射移植入大鼠皮膚創(chuàng)面,與對照組比較創(chuàng)面愈合率。
　　6.脂肪來源干細胞的培養(yǎng):依據(jù)傳統(tǒng)方法分離、純化、擴增ADSCs;通過流式細胞儀檢

4、測細胞表面標志物CD29、CD31及CD44;體外誘導ADSCs向成骨細胞及成脂細胞分化,采用茜素紅及油紅O染色鑒定,證實ADSCs具有成骨和成脂的多向分化能力。
　　7.脂肪來源干細胞的體內示蹤:體外觀察CM-DiI標記后ADSCs的細胞形態(tài);檢測體內移植CM-DiI標記的ADSCs后24h及5d的示蹤效果。
　　結果:
　　1.采用改良式分離VECs的方法,成功獲取大鼠VECs。
　　2.觀察原代及傳代VEC

5、s細胞形態(tài)及生長情況無明顯差異,MTT比色法檢測細胞的增殖率,長期凍存復蘇后仍能夠保持良好的生物學特性。
　　3.流式細胞儀(FCM)檢測CD31及第Ⅷ因子相關抗原均較高表達,初步明確分離培養(yǎng)的細胞為VECs。
　　4.將VECs移植入大鼠皮膚創(chuàng)面,與對照組相比,無明顯促愈和作用。
　　5.依據(jù)傳統(tǒng)方法分離培養(yǎng)的ADSCs,細胞生長良好;經(jīng)成骨和成脂誘導后,具有定向分化為骨細胞及脂肪細胞能力;CM-DiI能標記體外培養(yǎng)