血管內(nèi)皮細(xì)胞生物反應(yīng)器構(gòu)建的初步研究.pdf

1、目的：生物反應(yīng)器是一個(gè)由具有內(nèi)在網(wǎng)絡(luò)通道的聚合物構(gòu)成的立體框架結(jié)構(gòu),同時(shí)輔以流動(dòng)的培養(yǎng)液提供營(yíng)養(yǎng)。通道內(nèi)外相隔一層半透膜,這樣便為大量有效地培養(yǎng)細(xì)胞并使之發(fā)揮功能提供了條件。生物反應(yīng)器在生物型人工肝臟的應(yīng)用已有30多年的歷史。自從1972年Knazek設(shè)計(jì)了中空纖維生物反應(yīng)器,1975年Wolf等人將其應(yīng)用于肝細(xì)胞的培養(yǎng)后,生物反應(yīng)器在人工肝上的應(yīng)用不斷進(jìn)展。除此之外,中空纖維生物反應(yīng)器也被應(yīng)用于人工腎小管輔助裝置的構(gòu)建,研究者在采用該

2、裝置治療急性腎功能衰竭和膿毒癥的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)水平影響膿毒癥的預(yù)后。
　　 膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,具有發(fā)病率和死亡率高、治療效果差等特點(diǎn)。在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,內(nèi)皮細(xì)胞無(wú)論是形態(tài)還是功能上均受到嚴(yán)重的損害,而內(nèi)皮細(xì)胞的損害又進(jìn)一步加重了膿毒癥時(shí)的炎癥和凝血。那么,采用細(xì)胞療法體外替代內(nèi)皮細(xì)胞的功能是否能改善膿毒癥的預(yù)后呢?基于此設(shè)想,本課題通過(guò)在中空纖維生物反應(yīng)器的外腔種植內(nèi)

3、皮細(xì)胞,構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞生物反應(yīng)器,并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和生物活性進(jìn)行鑒定,以期為膿毒癥的治療提供一項(xiàng)新的手段。
　　 方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)分為三部分:
　　 1、局部試驗(yàn),探討內(nèi)皮細(xì)胞能否在聚砜膜中空纖維的外表面生長(zhǎng)。首先將聚砜膜中空纖維纏繞于蓋玻片上制成聚砜膜片,環(huán)氧乙烷滅菌處理,生理鹽水清洗,然后將其置于培養(yǎng)皿中。加入培養(yǎng)液和內(nèi)皮細(xì)胞,觀察內(nèi)皮細(xì)胞在聚砜膜中空纖維外表面的生長(zhǎng)情況。
　　 2、無(wú)紡布內(nèi)皮細(xì)

4、胞生物反應(yīng)器的構(gòu)建。先用生理鹽水對(duì)反應(yīng)器的內(nèi)腔和外腔進(jìn)行預(yù)沖,再將內(nèi)皮細(xì)胞懸液植入其外腔,封閉外腔口；內(nèi)腔與培養(yǎng)液循環(huán)式人工毛細(xì)管培養(yǎng)系統(tǒng)相連接,采用含10％胎牛血清和“雙抗”的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。管路連接后將整個(gè)裝置置于5％C02、37℃培養(yǎng)箱中孵育。定時(shí)取反應(yīng)器內(nèi)腔培養(yǎng)液,用于乳酸、葡萄糖、一氧化氮、蛋白C和vWF的檢測(cè)。內(nèi)皮細(xì)胞在生物反應(yīng)器外腔生長(zhǎng)5d后,剖開(kāi)反應(yīng)器外殼,取出其中的無(wú)紡布,行光鏡、熒光顯微鏡和電鏡檢查,

5、觀察內(nèi)皮細(xì)胞在無(wú)紡布上的生長(zhǎng)情況。
　　 3、微載體內(nèi)皮細(xì)胞生物反應(yīng)器的構(gòu)建。首先對(duì)微載體進(jìn)行水化膨脹、高壓滅菌處理,然后與內(nèi)皮細(xì)胞共同置于75cm2的培養(yǎng)瓶中,加入含10％胎牛血清和“雙抗”的DMEM高糖培養(yǎng)液,間斷振蕩培養(yǎng)。待內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)滿微載體表面后,行光鏡、熒光顯微鏡和電鏡檢查,觀察內(nèi)皮細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況。然后將長(zhǎng)滿內(nèi)皮細(xì)胞的微載體移入生物反應(yīng)器的外腔,封閉外腔口,內(nèi)腔與培養(yǎng)液循環(huán)式人工毛細(xì)管培養(yǎng)系統(tǒng)相連接(同無(wú)紡布

6、內(nèi)皮細(xì)胞生物反應(yīng)器的構(gòu)建),采用無(wú)血清、含“雙抗”的DEME高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。定時(shí)取反應(yīng)器內(nèi)腔培養(yǎng)液,用于乳酸和葡萄糖的檢測(cè)。
　　 結(jié)果
　　 1、局部試驗(yàn):
　　 光鏡、熒光顯微鏡下,聚砜膜中空纖維側(cè)面光滑,未見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞貼附、生長(zhǎng)。在同一培養(yǎng)皿中,內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
　　 2、無(wú)紡布內(nèi)皮細(xì)胞生物反應(yīng)器的構(gòu)建:
　　 熒光顯微鏡下,無(wú)紡布由長(zhǎng)短不一的絲狀物不規(guī)則交織而成,絲狀物表面可見(jiàn)大量

7、內(nèi)皮細(xì)胞貼附,密度均勻,細(xì)胞核有的呈橢圓形,有的呈細(xì)長(zhǎng)形,部分細(xì)胞可見(jiàn)雙核,增值明顯,罕見(jiàn)濃縮、碎裂的細(xì)胞核。電鏡下,內(nèi)皮細(xì)胞貼附于無(wú)紡布纖維絲的表面,大部分細(xì)胞伸出觸角,具有良好的內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)。
　　 培養(yǎng)液中乳酸的濃度隨時(shí)間變化進(jìn)行性升高,升高的速度逐漸加快,換液時(shí)濃度下降；葡萄糖的濃度則進(jìn)行性降低,降低的速度逐漸加快,換液時(shí),濃度上升；NO濃度在最初數(shù)小時(shí)內(nèi)有所降低,之后進(jìn)行性升高。
　　 內(nèi)皮細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)生長(zhǎng)

8、5d后取出反應(yīng)器外腔的培養(yǎng)液,離心后,內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量很少。將內(nèi)皮細(xì)胞種植于培養(yǎng)瓶中,2d后觀察內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,無(wú)污染。反應(yīng)器構(gòu)建120h(即構(gòu)建結(jié)束)時(shí)取反應(yīng)器外腔培養(yǎng)液進(jìn)行vWF、蛋白C的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)前者可檢測(cè)得出,但后者低于檢測(cè)范圍。
　　 3、微載體內(nèi)皮細(xì)胞生物反應(yīng)器的構(gòu)建
　　 光鏡下,內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)滿微載體表面,微載體表面凹凸不平。熒光纖維鏡下,內(nèi)皮細(xì)胞核貼附于微載體表面,分布均勻,罕見(jiàn)濃縮、碎裂的細(xì)胞核。電鏡下