大鼠骨髓干細胞的培養(yǎng)、誘導分化為骨骼肌治療骨骼肌缺損的動物模型的實驗研究.pdf

1、[目的] 驗證大鼠骨髓干細胞(MSCs)體外培養(yǎng)的方法及其生物學特性，研究MSCs的多項分化潛能以及其在體外定向誘導分化為骨骼肌細胞，設計一組動物模型，分別將誘導后、未誘導的MSCs、陽性對照細胞注射到動物模型體內(nèi)，研究MSCs在體內(nèi)的誘導分化情況及其最終的形態(tài)變化；從而，找到肌肉缺損最佳的修復方法，為臨床治療開拓廣闊的前景。 [方法] 首先培養(yǎng)大鼠骨髓干細胞(MSCs)、大鼠骨骼肌細胞(Mb，主要用于陽性對照)，將體外培養(yǎng)的

2、：MSCs第三代用5-氮雜胞苷誘聯(lián)合MyoD、TGF-β1、IGF-1導分化，用免疫組織化學方法鑒定誘導后的細胞。制做動物模型：取16只10周齡的Wistar大鼠，在其左后小腿脛前肌中部注射無水乙醇0.2ml，使其脛前肌中部變性壞死。右后小腿脛前肌中部注射無菌生理鹽水0.2ml。將16只大鼠模型隨機分成四組，第一組陰性對照，只注射培養(yǎng)基；第二組實驗組，注射MSCs；第三組實驗組，注射誘導后的MSCs；第四組陽性對照組，注射Mb。分別將第

3、三代細胞、誘導后的細胞用BrdU標記，然后收集等待注射。動物模型建立4h后，就可以注射。注射部位雙小腿脛前肌中部。在注射細胞后的第3d、6d、9d和12d分別取材進行形態(tài)觀察和免疫學檢查； [結果] 大鼠MSCs體外培養(yǎng)生長良好，形態(tài)不規(guī)則，流式細胞儀檢測絕大部分細胞處于G1期(79.4％)，免疫組化檢測CD44陽性，而CD34陰性。大鼠Mb體外培養(yǎng)生長良好，形態(tài)規(guī)則，流式細胞儀檢測絕大部分細胞處于G1期(79.8％)，免疫組化

4、檢測Desmine，Myosin均陽性。經(jīng)誘導后MSCs，形態(tài)多為三角性或纖維狀，兩周后，流式細胞儀檢測絕大部分細胞處于G1期(67.6％)，免疫組化檢測Desmine，Myosin均陽性，三周后有肌小管形成。在術后3d、6d，第一組沒有或很少BrdU標記細胞(假陽性)，組織切片免疫組化Desmine，Myosin抗體陰性；第二組 BrdU標記細胞很多，組織切片免疫組化兩種抗體陰性或弱陽性：第三、四組BrdU標記細胞很多，向骨骼肌細胞分

5、化，均為陽性表達； 9d、12d可見第一、二組兩種抗體弱陽性表達；第三、四組BrdU標記細胞明顯增多，Desmine，Mvosin強陽性表達。在高倍顯微鏡下計數(shù)BrdU標記的細胞數(shù)，運用配伍組設計資料的方差分析，經(jīng)過誘導MSCs注入體內(nèi)分化成骨骼肌能力明顯大于未經(jīng)過誘導的MSCs，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；經(jīng)體內(nèi)誘導MSCs在體內(nèi)增殖分化明顯增強的時間是在9d以后，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 [結論]大鼠骨髓干細胞具有多