大鼠去神經(jīng)骨骼肌MyoD的表達(dá).pdf

1、目的:探討MyoD在去神經(jīng)骨骼肌萎縮早期不同部位、不同時(shí)段的表達(dá)情況。 方法:選擇健康的雄性SD大鼠24只，體重195±5g，隨機(jī)分成4組，即對照組(有神經(jīng)支配)、實(shí)驗(yàn)A組(去神經(jīng)2d)、實(shí)驗(yàn)B組(去神經(jīng)7d)、實(shí)驗(yàn)C組(去神經(jīng)28d)，每組6只。大鼠分批用戊巴比妥鈉(40mg/kg，ip)麻醉后，用右下肢后部中段切斷坐骨神經(jīng)的方法制作失神經(jīng)骨骼肌動物模型，正常組僅做假手術(shù)(不切斷坐骨神經(jīng))，去神經(jīng)組切斷坐骨神經(jīng)1cm以上，分別

2、于去神經(jīng)第2d、7d、28d處死大鼠(用脊椎脫臼法)，用顯微外科技術(shù)認(rèn)真游離失神經(jīng)骨骼肌(脛骨前肌、比目魚肌、腓腸肌、跖肌)，切取的肌肉樣本快速置于-70℃冰箱凍存，備用。用RT-PCR法檢測MyoD的mRNA：以GAPDH作為內(nèi)參照，做半定量檢測。取樣本組織50mg勻漿后用上海生工抽提試劑進(jìn)行總RNA抽提，然后用MBI的RT-PCR試劑盒，按樣本RNA21μg，20μl體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。MyoD的引物通過primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)

3、計(jì)，為MyoD mRNA序列的175-316，片斷長度為151bp；作為內(nèi)參照的GAPDH的引物由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，片斷長度為308bp。聚合酶鏈反應(yīng)按50μl體系，反應(yīng)條件為：94℃，2'，1cycle。94℃，30"；Tm(MyoD 53℃)/(GAPDH50℃)，30"；72℃，2'，36 cycle。用瓊脂糖凝膠水平電泳，電壓采用160v。然后用凝膠成像儀獲取圖像。用免疫印跡法(Westemblot法)測定MyoD的蛋白

4、質(zhì)：用β-actin作為內(nèi)參照，做半定量檢測。取樣本組織100mg勻漿后用普利萊蛋白提取試劑盒進(jìn)行總蛋白抽提，煮沸、離心后，加樣于垂直電泳槽行SDS-PAGE，電泳約3h，轉(zhuǎn)膜1小時(shí)30分鐘，封閉室溫4小時(shí)，孵育一抗(Ab<,1>)4℃過夜，漂洗后孵育二抗(Ab<,2>)4℃約4小時(shí)，TBS漂洗后，置于暗室加ECL發(fā)光試劑盒反應(yīng)，一分鐘左右立即放在暗箱曝光，60秒左右取出浸入顯影劑內(nèi)，觀察至最佳顯影后，撈出在清水中洗凈，然后置于定影劑中

5、15分鐘，取出晾干后用數(shù)碼相機(jī)獲取圖片。最后用NIH的ImageJ軟件獲取數(shù)據(jù)，用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果:去神經(jīng)骨骼肌萎縮時(shí)，不同肌肉(脛骨前肌、比目魚肌、腓腸肌、跖肌)MyoD的mRNA和蛋白質(zhì)在去神經(jīng)支配后第2d、7d、28d不同時(shí)段表達(dá)均為上調(diào)，且與正常組進(jìn)行方差分析組間比較(Tukey HSD)，P<0.01，去神經(jīng)組比正常組高2倍左右，差異顯著。在每一時(shí)段，這四塊肌肉MyoD的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)用方差分析