COPD模型大鼠骨骼肌中Calpains蛋白及mRNA表達(dá)的研究.pdf

1、背景和目的：慢性阻塞性肺疾病(chronic obstluctive pulmonary disease,COPD)是呼吸系統(tǒng)多發(fā)病、常見(jiàn)病,具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點(diǎn),調(diào)查顯示在常見(jiàn)疾病中,COPD致死率位居第四位,并且其流行趨勢(shì)及致死率仍在繼續(xù)上升。對(duì)COPD的認(rèn)識(shí),目前比較公認(rèn)的觀點(diǎn)是:COPD不僅是局限于氣道和肺組織的炎癥反應(yīng)性伴結(jié)構(gòu)重塑性疾病,而是一種多因素參與、多環(huán)節(jié)相互作用的慢性系統(tǒng)性疾病。骨骼肌(包括膈肌)消

2、耗/萎縮作為廣為認(rèn)識(shí)的COPD全身不良效應(yīng)之一,不僅影響患者的日常生活,加重家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),并且嚴(yán)重影響疾病預(yù)后。研究表明,骨骼肌消耗/萎縮主要是由于肌纖維蛋白降解加速所致,同時(shí)骨骼肌細(xì)胞過(guò)度凋亡也起到重要作用。參與骨骼肌消耗/萎縮的途徑主要有有四條:依賴(lài)ATP的泛素.蛋白酶體途徑、caspases途徑、溶酶體途徑和Ca2+依賴(lài)蛋白酶途徑。其中Ca2+依賴(lài)蛋白酶途徑是Ca2+依賴(lài)的、高度可調(diào)的蛋白水解酶系統(tǒng),由鈣蛋白酶(calpai

3、ns)、鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)和鈣蛋白酶激活蛋白(calpain activator)三部分組成,參與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育、肌纖維蛋白降解、細(xì)胞凋亡和壞死等生理病理過(guò)程。Μ-Calpain平m-Calpain是Ca2+依賴(lài)蛋白酶系統(tǒng)中最重要、研究最深入的兩種鈣蛋白酶,兩者通過(guò)降解骨架蛋白和肌原纖維蛋白、介導(dǎo)肌細(xì)胞凋亡和壞死,從而在骨骼肌萎縮中發(fā)揮作用。已有研究表明μ-Calpain和m-Calpain參與失重、去神經(jīng)、糖皮

4、質(zhì)激素等誘導(dǎo)的骨骼肌萎縮過(guò)程;同時(shí),有研究顯示在過(guò)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的骨骼肌損傷中,兩者的表達(dá)及活性均顯著增強(qiáng),參與該過(guò)程的發(fā)生發(fā)展。但μ-Calpain和m-Calpain在COPD骨骼肌消耗/萎縮中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道,是否calpains也參與COPD骨骼消耗/萎縮過(guò)程?循此思路,設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)研究,借助大鼠COPD模型,通過(guò)檢測(cè)具有代表性的骨骼肌——膈肌和趾長(zhǎng)伸肌中μ-Calpain和m-Calpain蛋白及mRNA的表達(dá),研究μ-Calpai

5、n和m-Calpain的表達(dá)在COPD大鼠骨骼肌中的變化,初步探討Calpains在COPD骨骼肌消耗/萎縮中的作用。
　　 材料與方法：將40只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組20只,對(duì)照組20只。模型組采用如下方法進(jìn)行造模:第1天和第14天氣管內(nèi)注入脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),第2～13天、15～28天在自制密閉染毒箱內(nèi)熏5％紅旗渠牌香煙,每日兩次,每次持續(xù)0.5h。對(duì)照組在模型組氣管內(nèi)注入

6、LPS的當(dāng)天,以相同方式氣管內(nèi)注入等量滅菌生理鹽水,其余時(shí)間不做任何干預(yù)。造模成功,于實(shí)驗(yàn)第29天處死全部大鼠,取肺組織、膈肌及雙側(cè)趾長(zhǎng)伸肌進(jìn)行如下測(cè)定:
　　 1.肺組織及骨骼肌組織病理切片HE染色2、免疫組織化學(xué)測(cè)定骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain蛋白的表達(dá)3、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定骨骼肌中μ-Calpain和m-Calpain mRNA的表達(dá)結(jié)果1、肺組織病理切片HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察,可見(jiàn)模

7、型組大鼠肺組織出現(xiàn)COPD特征性病理變化,證實(shí)造模成功。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠膈肌及趾長(zhǎng)伸肌組織病理切片,可見(jiàn)模型組大鼠骨骼肌纖維出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象,排列疏松、紊亂,胞核排列不規(guī)則、大小不等。
　　 2.免疫組化結(jié)果顯示COPD模型組大鼠膈肌和趾長(zhǎng)伸肌中μ-Calpain蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P＜0.01),COPD模型組大鼠膈肌及趾長(zhǎng)伸肌中m-Calpain蛋白表達(dá)較對(duì)照組亦顯著增強(qiáng)(P＜0.01),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

8、　 3.RT-PCR檢測(cè)膈肌和趾長(zhǎng)伸肌組織中μ-Calpain mRNA表達(dá),模型組和對(duì)照組比較,差異不顯著,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。M-Calpain mRNA在模型組膈肌和趾長(zhǎng)伸肌中的表達(dá)均較對(duì)照組增強(qiáng)(P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：COPD模型大鼠骨骼肌存在萎縮現(xiàn)象,并且骨骼肌組織中μ-Calpain和m-Calpmn蛋白表達(dá)增強(qiáng),m-Calpain mRNA表達(dá)增強(qiáng),提示Calpains在COP