AMP激活的蛋白激酶在COPD大鼠骨骼肌線粒體生物合成調(diào)控中的作用機制研究.pdf

1、第一部分，大鼠COPD模型建立及干預
　　 背景和目的:
　　 慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是一種以氣流受限為特征的慢性氣道疾病，同時也是一種涉及多器官受損的全身疾病。近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，部分運動受限的COPD患者表現(xiàn)為明顯的骨骼肌功能障礙。對中、重度COPD患者，骨骼肌的消耗成為預計患者病死率的重要指標之一。
　　 COPD的骨骼肌功能障礙

2、形成機制復雜，系統(tǒng)性炎癥在COPD患者中的存在已被廣泛接受，有人認為炎癥是COPD患者骨骼肌功能障礙的始動因素。其中腫瘤壞死因子-α(Tumornecrosisfactor-α，TNF-α)作為一種重要炎癥介質(zhì)已被證明參與了COPD的炎癥過程。
　　 線粒體是骨骼肌運動所需能量的生成場所，也是活性氧(ROS)產(chǎn)生的主要場所，同時也處于細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。因此，線粒體功能障礙在COPD的骨骼肌功能障礙中越來越受到重視。已有研究發(fā)現(xiàn)

3、，中重度COPD患者出現(xiàn)運動性骨骼肌萎縮、骨骼肌線粒體密度減少及結(jié)構(gòu)異常。
　　 我們擬通過建立COPD大鼠模型，觀察COPD模型大鼠骨骼肌形態(tài)學變化及電鏡下骨骼肌纖維與線粒體變化，同時給予白藜蘆醇及AMP激活的蛋白激酶(Adenosine5‘-monophosphate(AMP)-activatedproteinkinase，AMPK)激動劑干預。評估外周血及骨骼肌TNF-α水平與骨骼肌與線粒體的結(jié)構(gòu)形態(tài)改變的關(guān)系，為炎癥在C

4、OPD骨骼肌功能障礙中的損傷作用機制提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.COPD大鼠模型制備用兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)和反復煙熏的方法制作COPD大鼠模型。
　　 2.分組與處理雄性SD大鼠隨機分為對照組、COPD模型組、AICAR（AMPK特異性激動劑）組和白藜蘆醇組，對照組和模型組分別給予生理鹽水、AICAR、白藜蘆醇。
　　 3.肺功能采用無束縛小動物肺功能儀(Buxco，USA)測定大鼠

5、肺功能變化。
　　 4.肺和骨骼肌病理采用HE、Masson染色光學顯微鏡下觀察各組肺臟和骨骼肌的病理變化。及電鏡觀察骨骼肌與線粒體的超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果:
　　 1.各實驗組大鼠行為變化模型組及各治療組大鼠早期出現(xiàn)躁動不安、咳嗽、氣急、、進食進水量逐漸減少等表現(xiàn)。正常對照組則始終未見上述表現(xiàn)。各組體重改變差異無顯著性。
　　 2.各實驗組大鼠肺功能變化與對照組比較，模型組大鼠PEF明顯降低(P＜0

6、.01)，VT明顯降低（P＜0.05），EF50明顯降低(P＜0.05)。AICAR和白藜蘆醇組PEF、均較模型組明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。AICAR和白藜蘆醇組VT均較模型組明顯升高、EF50(P＜0.05)。AICAR和白藜蘆醇組EF50均較模型組明顯升高(P＜0.05)AICAR和白藜蘆醇組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 3.大鼠肺組織病理變化COPD模型組可見廣泛肺泡壁增厚、破壞，肺泡破裂、

7、融合，小氣道纖毛脫落，氣腔狹窄，小血管壁增厚。AICAR組肺組織可見中量炎癥細胞浸潤，肺泡壁破壞、肺泡融合，肺泡腔增大;白藜蘆醇組肺組織可見中量炎癥細胞浸潤，肺泡壁破壞、小氣道纖毛脫落，氣腔狹窄。
　　 4.骨骼肌細胞形態(tài)學觀察COPD模型組大鼠骨骼肌細胞輕度萎縮，膠原纖維沉積較對照組明顯增多。白藜蘆醇和AICAR組大鼠組骨骼肌細胞較COPD模型組大鼠膠原纖維沉積減少。透射電鏡下觀察顯示:模型組大鼠的小腿三頭肌線粒體減少，出現(xiàn)腫

8、脹，水性變及空泡化，內(nèi)膜、嵴破壞溶解改變;白藜蘆醇組及AICAR組大鼠的小腿三頭肌線粒體結(jié)構(gòu)尚完整，肌絲完整，肌原纖維排列整齊，分布正常。
　　 結(jié)論:
　　 1.兩次氣管內(nèi)注入脂多糖(LPS)和反復煙熏的方法可成功制作COPD大鼠模型。
　　 2.COPD模型大鼠骨骼肌存在骨骼肌炎癥及線粒體損傷。
　　 3.AICAR及白藜蘆醇可以改善COPD模型大鼠骨骼肌炎癥反應，減輕線粒體結(jié)構(gòu)損傷。
　　

9、第二部分，AMPK對COPD大鼠骨骼肌線粒體合成調(diào)控中的作用及白藜蘆醇作用機制探討
　　 背景和目的:
　　 近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，部分運動受限的COPD患者表現(xiàn)為明顯的骨骼肌功能障礙。COPD的骨骼肌功能障礙形成機制復雜，系統(tǒng)性炎癥在COPD患者中的存在已被廣泛接受，TNF-α作為一種重要炎癥介質(zhì)已被證明參與了COPD的炎癥過程。
　　 AMPK作為真核生物細胞中一個重要的蛋白激酶，參與細胞的能量代謝過程，其通

10、過調(diào)控代謝相關(guān)酶起作用。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)AMPK的下游靶蛋白參與能量代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。但是AMPK是否參與炎癥介導的COPD骨骼肌線粒體生物合成障礙目前一無所知。
　　 本研究擬通過觀察大鼠外周血與骨骼肌TNF-α水平、骨骼肌AMPK表達、PGC-1α及線粒體生物合成相關(guān)基因表達的變化，進而探討炎癥狀態(tài)下COPD模型大鼠骨骼肌線粒體合成的的影響，同時給予AMPK激動劑及白藜蘆醇干預后觀察PGC-1α變化及對骨骼肌線粒體生物合成的影響，

11、為治療COPD骨骼肌障礙提供新的理論基礎。
　　 方法:
　　 1.COPD大鼠模型制備與分組與處理同第一部分。
　　 2.取材與處理采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清TNF-α濃度;小腿三頭肌留取組織勻漿，取上清液采用ELISA法檢測TNF-α濃度;采用熒光定量PCR分析檢測AMPK、NRF-1、PGC-1α、Tfam、COXⅣmRNA表達;采用Westernblotting檢測AMPK、TNF-α、PG

12、C-1α、Tfam、COXⅣ蛋白表達。
　　 結(jié)果:
　　 1.不同組別血清TNF-α的水平與對照組比較，模型組大鼠血清TNF-a明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組間無顯著統(tǒng)計學差異，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 2.不同組別骨骼肌TNF-α的水平與對照組比較，模型組

13、大鼠骨骼肌TNFa明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR組骨骼肌TNFa明顯低于白藜蘆醇組，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.不同組別骨骼肌AMPKmRNA及蛋白表達的變化與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌AMPKmRNA相對含量明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇

14、組均較模型組明顯升高（組間比較差異具有統(tǒng)計學意義P＜0.01）。AICAR組AMPKmRNA相對含量明顯高于白藜蘆醇組，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌AMPK蛋白相對含量明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。白藜蘆醇組AMPK蛋白相對含量明顯低于AICAR組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.

15、05)。
　　 4.不同組別骨骼肌PGC-IamRNA及蛋白表達的變化與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌PGC-1amRNA相對含量明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AICAR組與白藜蘆醇組間無明顯統(tǒng)計學差異，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌PGCla蛋白相對含量明顯降低，組間比較差異具有

16、統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。白藜蘆醇組PGCla蛋白相對含量明顯高于AICAR組，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 5.不同組別骨骼肌NRF-1mRNA及蛋白表達的變化與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌NRFlmRNA明顯降低(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高（P＜0.05）。AICAR組與白藜蘆醇組間無明

17、顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌NRF1蛋白明顯降低(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P＜0.01)。白藜蘆醇組NRF1蛋白明顯高于AICAR組(P＜0.01)。
　　 6.不同組別骨骼肌TfammRNA及蛋白表達的變化與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌TfammRNA明顯降低(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)。AICAR組與

18、白藜蘆醇組間無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌Tfam蛋白明顯降低(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P＜0.01)。白藜蘆醇組Tfam蛋白明顯高于AICAR組(P＜0.01)。
　　 7.不同組別骨骼肌COXIVmRNA及蛋白表達的變化與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌COXIVmRNA明顯降低(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高（P＜0.05）。AICA

19、R組與白藜蘆醇組間無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。與對照組比較，模型組大鼠骨骼肌COXIV蛋白明顯降低(P＜0.01)。AICAR和白藜蘆醇組均較模型組明顯升高(P＜0.01)。白藜蘆醇組COXⅣ蛋白明顯高于AICAR組（P＜0.01）。
　　 8.相關(guān)性分析骨骼肌TNF-a和AMPK呈負相關(guān)關(guān)系(R=-0.454，P＜0.01)。骨骼肌PGC-1amRNA和AMPKmRNA呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.278，P＜0.05)。骨骼肌

20、TNF-a和PGC-1amRNA呈負相關(guān)關(guān)系(R=-0.780，P＜0.01)。骨骼肌PGC-1amRNA和NRFmRNA呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.685，P＜0.01)。骨骼肌PGC-1amRNA和TfammRNA呈正相關(guān)關(guān)系(R=0.800，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.COPD大鼠骨骼肌存在TNF-α介導的炎癥。
　　 2.COPD大鼠骨骼肌AMPK水平下降，PGC-1α表達下降影響骨骼肌線粒體生物