線粒體穩(wěn)態(tài)在運(yùn)動延緩骨骼肌炎性反應(yīng)中的作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的：炎癥與許多疾病密切相關(guān)，衰老發(fā)生過程伴隨著炎癥因子慢性進(jìn)行性升高的現(xiàn)象，并伴有衰老性肌萎縮和骨骼肌線粒體生物合成功能降低。炎癥因子能引起衰老性肌萎縮已被明確證實(shí)，且抗炎因子治療可減緩這一過程。IL-6是衰老性肌萎縮發(fā)生的必要因子，過表達(dá) IL-6可加速肌萎縮的過程。有證據(jù)表明，用IL-6直接孵育骨骼肌肌原細(xì)胞，線粒體融合蛋白MFN2表達(dá)降低，然而在IL-6引起衰老性肌萎縮過程中線粒體穩(wěn)態(tài)的作用機(jī)制尚未明確。運(yùn)動可作為防治衰老性

2、肌萎縮等相關(guān)疾病的重要措施，研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度的運(yùn)動可逆轉(zhuǎn)由 IL-6過表達(dá)引起的骨骼肌肌肉質(zhì)量的降低。本研究首先建立 C57小鼠炎癥模型，探討在IL-6引起的衰老性肌萎縮過程中，骨骼肌線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用以及中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動干預(yù)對其的改善作用。
　　研究方法：
　　1、動物模型的建立：8月齡C57雄性小鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)及適應(yīng)性訓(xùn)練一周后，隨機(jī)分為安靜組和運(yùn)動組。運(yùn)動組開始中等強(qiáng)度12m/min（76％VO2max）跑臺訓(xùn)練，

3、每天30分鐘。訓(xùn)練開始后第4周，安靜組和運(yùn)動組各隨機(jī)分成兩組，分別注射 IL-6或生理鹽水，最終分為以下四組：
　?、侔察o生理鹽水對照組（R，N=10）；
　?、谶\(yùn)動生理鹽水對照組（E，N=10）；
　?、郯察oIL-6注射組（RI，N=10）；
　　④運(yùn)動IL-6注射組(EI，N=10)。
　　2、通過摘除眼球取血的方式對血清IL-6和TNF-α水平進(jìn)行ELISA測定。
　　3、骨骼肌線粒體提取定量后

4、，用Oxygraph-2k細(xì)胞呼吸測量儀（Oroboros，Austria）測定線粒體態(tài)3呼吸（State3）、態(tài)4呼吸（State4）并計(jì)算呼吸控制比（RCR）；熒光分光光度計(jì)測定JC-1標(biāo)示線粒體膜電位和DCFH-DA方法測定線粒體H2O2生成速率；Western-blotting法測定COX IV、PGC-1α、IL-6、NFκB、TNF-α等參與線粒體穩(wěn)態(tài)及生物合成相關(guān)蛋白含量。
　　研究結(jié)果：
　　（1）模型建立：

5、ELISA測定小鼠血清炎性因子TNF-α含量：血清ELISA檢測安靜IL-6注射組小鼠TNF-α含量顯著高于安靜生理鹽水對照組（p<0.05）。運(yùn)動生理鹽水對照組及運(yùn)動IL-6注射組較安靜IL-6注射組TNF-α含量明顯降低（p<0.01）。
　　（2）運(yùn)動和IL-6注射動物模型中，安靜 IL-6注射組股四頭肌濕重/體重（mg/g）比值顯著低于安靜生理鹽水對照組（p<0.05）；運(yùn)動生理鹽水對照組與運(yùn)動IL-6注射組之間不具顯著性

6、（p>0.05）。
　　（3）小鼠骨骼肌線粒體呼吸功能：中等強(qiáng)度運(yùn)動訓(xùn)練可以提高線粒體呼吸功能，運(yùn)動 IL-6注射組小鼠與安靜IL-6注射組小鼠線粒體呼吸控制比（RCR）呈現(xiàn)顯著性差異（p<0.05）。運(yùn)動可以顯著影響態(tài)3呼吸，運(yùn)動IL-6注射組動物的態(tài)3呼吸顯著高于安靜IL-6注射組動物（p<0.05）。運(yùn)動生理鹽水對照組比安靜生理鹽水對照組態(tài)3呼吸顯著升高（p<0.01），但態(tài)4并沒有顯著性變化。
　　（4）各組ROS生

7、成速率：運(yùn)動生理鹽水對照組小鼠ROS生成速率顯著性低于安靜生理鹽水對照組小鼠（p<0.05），并且運(yùn)動和IL-6注射均能顯著影響小鼠線粒體ROS生成速率。與安靜IL-6注射組相比，運(yùn)動IL-6注射組ROS顯著性低于安靜IL-6注射組（p<0.01）。
　?。?）各組線粒體膜電位結(jié)果：運(yùn)動生理鹽水對照組小鼠線粒體膜電位顯著性高于安靜生理鹽水對照組小鼠（p<0.05），安靜IL-6注射組膜電位顯著低于安靜生理鹽水對照組（p<0.05）

8、。
　　（6）蛋白表達(dá)分析：PGC-1α：在接受IL-6注射的小鼠中，PGC-1α蛋白顯著低于其它各組，運(yùn)動IL-6注射組小鼠骨骼肌線粒體PGC-1α蛋白表達(dá)顯著高于安靜IL-6注射組（p<0.05）；而在接受生理鹽水注射的小鼠中，運(yùn)動對照組顯著性高于安靜對照組（p<0.05）。COXIV：運(yùn)動生理鹽水對照組小鼠線粒體COXIV蛋白顯著高于安靜生理鹽水對照組（p<0.05）；運(yùn)動IL-6注射組小鼠線粒體COX IV蛋白顯著性高于安

9、靜IL-6注射組（p<0.05）；IL-6：安靜生理鹽水對照組小鼠線粒體IL-6蛋白表達(dá)顯著高于運(yùn)動生理鹽水對照組（p<0.05），安靜IL-6注射組小鼠線粒體IL-6蛋白表達(dá)顯著高于安靜生理鹽水對照組及運(yùn)動IL-6注射組（p<0.05，p<0.01）；NFκB：安靜IL-6注射組小鼠線粒體NFκB蛋白顯著高于安靜生理鹽水對照組（p<0.05），運(yùn)動IL-6注射組小鼠骨骼肌線粒體NFκB蛋白顯著低于安靜IL-6注射組小鼠（p<0.05）

10、；TNF-α：安靜IL-6注射組小鼠骨骼肌TNF-α蛋白比同樣條件下安靜生理鹽水對照組有顯著性升高（p<0.01），運(yùn)動IL-6注射組小鼠與同樣條件下安靜IL-6注射組相比顯著性降低（p<0.05），運(yùn)動生理鹽水對照組小鼠與同樣條件下安靜生理鹽水對照組相比有顯著性降低（p<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　1、外源性炎性因子IL-6可引起骨骼肌ROS水平升高，同時骨骼肌線粒體呼吸功能降低，線粒體生物合成相關(guān)蛋白PGC-1α和