骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)再生性實驗研究.pdf

1、背景：
　　外傷事故、腫瘤切除、退行性疾病導(dǎo)致骨骼肌損傷，會造成大面積骨骼肌缺損(VML)，發(fā)病率較高，治療方法卻有限。雖然人體骨骼肌在損傷后有強(qiáng)大的再生能力，但是這種再生反應(yīng)依賴肌肉損傷的嚴(yán)重性。一般來說，如果超過20％肌肉的喪失，那么自然修復(fù)過程就會失敗，并且導(dǎo)致疤痕組織形成，缺損處遠(yuǎn)端肌肉去神經(jīng)化，導(dǎo)致功能喪失。明顯，需要更好的治療方法，當(dāng)骨骼肌受到創(chuàng)傷時，可以促進(jìn)骨骼肌自身修復(fù)和再生，并且能夠誘導(dǎo)肌肉的合成功能。
　

2、　把干細(xì)胞接種到全器官脫細(xì)胞基質(zhì)中，獲得組織工程肺、肝和心臟以供活體植入，是能夠?qū)崿F(xiàn)的。骨骼肌占到了人體的40-50％，肌肉骨骼的創(chuàng)傷，包括大面積缺損，是很常見的。由于骨骼是功能單一的器官，通過把干細(xì)胞接種到骨骼肌支架(ECM)，來獲取組織工程肌肉應(yīng)該比較容易。最近的研究表明，來源于同源組織的肝臟和肺臟生物學(xué)支架可能比非特異組織更加適合于組織重構(gòu)。迄今為止，人們已經(jīng)多次嘗試對骨骼肌ECM進(jìn)行脫細(xì)胞，但至今尚未報道獲得完整的帶有血管網(wǎng)的細(xì)

3、胞外基質(zhì)。
　　來自器官脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)補(bǔ)片有廣闊的前景，將會越來越多的生物材料應(yīng)用到組織工程領(lǐng)域。骨骼肌脫細(xì)胞基質(zhì)很少被報道及描述，骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)(PM-ECM)修補(bǔ)大面積肌肉缺損的生物活性及功能還不是很清楚。在目前研究中，PM-ECM來源于腹直肌(RA)，豬的腹直肌灌注脫細(xì)胞技術(shù)能夠有效的將細(xì)胞及重要物質(zhì)分離出去，并且保留原有腹直肌復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)，且保留了部分生物活性物質(zhì)及機(jī)械性能。我們?yōu)槭裁催x擇豬的腹

4、直肌作為原材料，先看下豬腹直肌的解剖。(1)腹直肌結(jié)構(gòu):腹直肌常被用作肌肉瓣、肌皮瓣、帶蒂皮瓣瓣或游離瓣，不受大小或形態(tài)的限制，這使得它具有了大量的臨床用途，包括乳房切除術(shù)后的重建，胸壁重建，咽部或食道重建，局部晚期軟組織肉瘤切除后的重建，頭部和頸部區(qū)域的重建手術(shù)。腹直肌是相對獨(dú)立的骨骼肌，其周圍環(huán)繞著腹直肌鞘，血供豐富。腹直肌的動脈血管是由腹壁上動脈（位于第七肋骨處的胸廓內(nèi)動脈的分支）和腹壁下動脈（髂外動脈的分支）組成的。腹壁下動脈支

5、配經(jīng)腹直肌和后鞘，在臍部分成若干支血管與腹壁上動脈匯合。4、5肋間動脈后方的末端分支和腰動脈以及腹壁下動脈之間，也有血管的匯合。按照解剖學(xué)的觀點(diǎn)，豬的腹直肌與人的十分相似，包括周圍的結(jié)構(gòu)和內(nèi)部血管的分支方式。(2)腹直肌的結(jié)構(gòu)和血管:最小的收縮單位是肌纖維，它是圓柱形的、多核、肌小管組成每一束肌纖維被肌內(nèi)膜包裹，大約20-80個平行肌纖維裹在一起形成肌束或纖維從，被肌束膜包裹，它比肌內(nèi)膜厚，肌肉由很多肌束形成，外面被外在的膠原覆蓋，稱為

6、肌外膜。肌肉的主要血管沿長軸分布，滋養(yǎng)血管從右側(cè)或斜面從主干血管進(jìn)入肌外膜，小動脈進(jìn)入肌束膜后垂直進(jìn)入肌纖維，發(fā)出終末血管進(jìn)入肌束膜后成為毛細(xì)血管，無數(shù)的毛細(xì)血管嵌入肌內(nèi)膜，供應(yīng)平行的肌纖維。毛細(xì)血管在肌肉中直徑大約4um.毛細(xì)血管后靜脈管徑稍粗，不是來源伴行的靜脈，而是來之動脈。
　　目的：
　　從豬的腹直肌(RA)灌注脫細(xì)胞得到PM-ECM支架;比較PM-ECM與SIS材料的理化特性，完成體外種植C2C12細(xì)胞試驗評估;

7、建立SD大鼠腹壁缺損模型，比較PM-ECM與SIS補(bǔ)片的修復(fù)效果，重點(diǎn)在于組織的重構(gòu)、血管再生及生物相容性，為尋求理想的生物材料提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分 豬的腹直肌(RA)灌注脫細(xì)胞基質(zhì)PM-ECM支架的制備及評估
　　1.完成豬腹直肌取材，按灌注脫細(xì)胞的流程制備腹直肌脫細(xì)胞基質(zhì)(PM-ECM)。
　　2.制備SIS補(bǔ)片
　　3.檢測PM-ECM中DNA、SDS、GAG、bFGF、EGFR的

8、含量，與SIS補(bǔ)片進(jìn)行比較，免疫組化實驗標(biāo)識層連接蛋白、Ⅳ膠原蛋白、纖維連接蛋白，電鏡下觀察基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，檢驗PM-ECM脫細(xì)胞的徹底性。
　　4.檢測PM-ECM的生物力學(xué)情況。
　　第二部分 PM-ECM支架體外生物活性檢測及評估
　　1.體外C2C12種植PM-ECM、SIS降解產(chǎn)物培養(yǎng)基上，小室法觀察在不同基質(zhì)濃度下C2C12遷移情況。
　　2.比較C2C12細(xì)胞在PM-ECM、SIS降解產(chǎn)物培養(yǎng)基中的分

9、化及增殖情況
　　3.使用Alamar-blue法觀察C2C12細(xì)胞在PM-ECM、SIS表面的代謝情況。
　　第三部分 PM-ECM、SIS修復(fù)大鼠腹壁缺損模型的效果及評估
　　1.將36只SD大鼠隨機(jī)分成6組，每組6只，人為制造腹壁缺損模型，分別采用PM-ECM、SIS修補(bǔ)缺損，設(shè)置空白對照。
　　2.術(shù)后觀察有無死亡，有無無傷口破裂或手術(shù)部位感染。無修復(fù)區(qū)腹壁松弛或瘺管形成。
　　3.第2周、8周分別

10、處死，觀察有無血清腫發(fā)生，切下修復(fù)區(qū)的標(biāo)本送組織切片，觀察修復(fù)區(qū)域肌纖維、血管、神經(jīng)細(xì)胞的再生情況以及補(bǔ)片的皺縮及松弛情況。
　　結(jié)果：
　　1.骨骼肌灌注脫細(xì)胞徹底，SKWOACM的組織學(xué)和掃描電鏡檢查均未見任何細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分，DAPI染色陰性;在完全冷凍干燥的PM-ECM中DNA含量低于500ng/mg，據(jù)此計算天然骨骼肌中99.5％的DNA已被清除;殘留DNA均為短鏈DNA（200-500bp）;符合脫細(xì)胞金標(biāo)準(zhǔn)。②無

11、殘留化學(xué)物質(zhì)、消毒滅菌不影響其生物學(xué)特性。③保留了天然骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)三維平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)，骨骼肌基底膜貼附于肌內(nèi)膜內(nèi)面。④保留有主干血管和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，可見終末動脈和伴行的2條終末靜脈;組織結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部的血管基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)能耐受經(jīng)支配血管灌注的300mmHg高壓液體而僅有遠(yuǎn)切端少許滲漏。⑤保留有脫細(xì)胞的肌肉-肌腱接頭結(jié)構(gòu)，可直接傳導(dǎo)力學(xué)。⑥PM-ECM保留有多種生物活性成分:免疫組化染色證實PM-ECM中含

12、有骨骼肌基底膜主要成分蛋白如Ⅳ型膠原、層連蛋白、纖維連接蛋白。⑦PM-ECM可制成多種形式衍生物，包括薄片、微粒、流體化組合物、凝膠;生物力學(xué)測試，PM-ECM的極限抗拉強(qiáng)度類似于天然肌肉，PM-ECM相比SIS具有更大抗拉強(qiáng)度。
　　2.PM-ECM濃度為50μg/ml時即達(dá)到促成肌細(xì)胞趨化最佳效果、在濃度50μg/ml時即達(dá)到促成肌細(xì)胞增殖和分化最佳效果，體外實驗結(jié)果PM-ECM組優(yōu)于SIS組，同時也證明PM-ECM降解產(chǎn)物在

13、體外能促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化、增殖及代謝活動。
　　3.PM-ECM、SIS修復(fù)大鼠腹壁缺損模型(VML)，通過觀察生物補(bǔ)片修補(bǔ)血清腫發(fā)病率高，PM-ECM修補(bǔ)區(qū)域的在新生血管生成、肌纖維生長、神經(jīng)纖維細(xì)胞生成、肌肉再生以及補(bǔ)片皺縮方面都優(yōu)于SIS補(bǔ)片，PM-ECM具有良好的生物安全性，證實PM-ECM在大鼠體內(nèi)修復(fù)腹壁缺損是安全、可行的。
　　結(jié)論：
　　1.骨骼肌血管灌注脫細(xì)胞徹底;PM-ECM保留了天然骨骼肌細(xì)胞外基

14、質(zhì)三維平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu);保留了GAG、bFGF、EGFR等生物活性因子;2.PM-ECM體外評估實驗，觀察C2C12細(xì)胞在PM-ECM、SIS降解成分的培養(yǎng)基中遷移、分化及增殖過程，PM-ECM濃度為50μg/ml時即達(dá)到促成肌細(xì)胞趨化最佳效果、在濃度50μg/ml時即達(dá)到促成肌細(xì)胞增殖和分化最佳效果，體外實驗結(jié)果PM-ECM組優(yōu)于SIS組，同時也證明PM-ECM降解產(chǎn)物在體外能促進(jìn)成肌細(xì)胞的分化、增殖及