MicroRNA-214對(duì)H2O2損傷L6骨骼肌成肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:心肌梗死是冠狀動(dòng)脈閉塞，血流中斷，使部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血而發(fā)生局部壞死所引起的病癥，嚴(yán)重威脅人類健康。在心梗區(qū)會(huì)產(chǎn)生較多的活性氧化物，使得心肌發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，其中H2O2是較常見的活性氧化物。由于心肌是終末分化細(xì)胞，一旦損傷后只能由纖維組織所代替，常規(guī)治療手段不能逆轉(zhuǎn)已經(jīng)壞死的心肌細(xì)胞。而干細(xì)胞移植治療心肌梗塞被認(rèn)為是前景光明的治療手段，其中骨骼肌成肌細(xì)胞與心肌細(xì)胞都來(lái)源于中胚層，具有可以自體移植等理想

2、特性，移植治療心梗效果顯著。但移植細(xì)胞在宿主心肌中的存活率直接影響了治療效果，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)移植后3天內(nèi)70％-80％的移植細(xì)胞死亡，其最主要的原因是在缺血環(huán)境下發(fā)生氧化應(yīng)激而引起的細(xì)胞凋亡。近些年一些研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs(miRNAs)對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程有一定的調(diào)控作用，而且不同的miRNAs的作用也不盡相同，其中miRNA-214(miR-214)是miRNAs家族的重要成員。研究表明miR-214對(duì)氧化應(yīng)激損傷的心

3、肌具有一定的保護(hù)作用，對(duì)正常成肌細(xì)胞增殖分化也有調(diào)節(jié)作用。因此本實(shí)驗(yàn)擬建立體外L6骨骼成肌細(xì)胞（L6 Skeletal Myobalst，L6SKM）H2O2損傷模型，觀察miR-214在不同損傷條件下的表達(dá)調(diào)節(jié)，并通過(guò)提前給予miR-214前體和抑制劑，上調(diào)和下調(diào)miR-214的表達(dá)，觀察成肌細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的增殖與凋亡變化，并探討其機(jī)制。
　　方法:
　　1、miR-214對(duì)L6SKM增殖的作用
　　體外培養(yǎng)L

4、6SKM，狀態(tài)良好時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214，實(shí)驗(yàn)分為五組（正常對(duì)照組、pre-miR-214組、pre-scramble組、anti-miR-214組、anti-scramble組，24小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法(qPCR)測(cè)定各組中miR-214的表達(dá)，MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中PCNA和cyclinD1的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞周期的變化，計(jì)算增殖指數(shù)(PI)。
　　2、分

5、化培養(yǎng)不同時(shí)間，L6SKM中miR-214、myo D、myogenin的表達(dá)
　　體外培養(yǎng)L6SKM，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，當(dāng)細(xì)胞融合到60％-70％時(shí)換2％馬血清的培養(yǎng)基，分別分化培養(yǎng)0天、2天、4天、6天。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法(qPCR)測(cè)定各組中miR-214、myo D、myogenin的表達(dá)。
　　3、轉(zhuǎn)染miR-214后再分化培養(yǎng)不同時(shí)間L6SKM中miR-214、myo D、myogenin的表達(dá)
　　體外

6、培養(yǎng)L6SKM，狀態(tài)良好時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214，實(shí)驗(yàn)分為五組（正常對(duì)照組、pre-miR-214組、pre-scramble組、anti-miR-214組、anti-scramble組），轉(zhuǎn)染后孵育24小時(shí)，換2％馬血清的培養(yǎng)基，分別分化培養(yǎng)0天、2天、4天。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法(qPCR)測(cè)定各組中miR-214、myo D、myogenin的表達(dá)。
　　4、不同濃度不同時(shí)間H2O2對(duì)L6SKM的作用
　　體外培養(yǎng)L6SKM

7、，實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組(normal control)，H2O2作用組（H2O2濃度分別是50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L、400μmol/L、600μmol/L,作用時(shí)間為4h），通過(guò)MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力并計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)時(shí)定量PCR法(qPCR)測(cè)定各組中miR-214的表達(dá);300μmol/LH2O2培養(yǎng)L6SKM不同時(shí)間(0.5h、1h、3h、4h、5h、7h)，MTT比色法檢測(cè)

8、各組細(xì)胞活力，實(shí)時(shí)定量PCR法(qPCR)測(cè)定各組中miR-214的表達(dá)。
　　5、miR-214對(duì)H2O2損傷L6SKM增殖和凋亡的作用
　　體外培養(yǎng)L6SKM，狀態(tài)良好時(shí)轉(zhuǎn)染miR-214，轉(zhuǎn)染后孵育24小時(shí)，再給予300μmol/L H2O2作用4h。實(shí)驗(yàn)分為六組，分別是正常對(duì)照組、H2O2組、pre-miR-214+H2O2組、pre-scramble+H2O2組、anti-miR-214+H2O2組、anti-sc

9、ramble+H2O2組。MTT比色法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)PCNA和cyclin D1的表達(dá)，流式細(xì)胞技術(shù)方法檢測(cè)細(xì)胞周期計(jì)算增殖指數(shù)(PI)和細(xì)胞凋亡，Western blotting法檢測(cè)caspase-3、Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、miR-214對(duì)L6SKM增殖的影響
　　qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示pre-miR-214組miR-214表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，anti-mi

10、R-214能夠明顯抑制miR-214表達(dá)，而正常對(duì)照組和pre-scramble組、anti-scramble組miR-214表達(dá)無(wú)差異，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。
　　MTT比色法結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比pre-miR-214組細(xì)胞活力明顯增加，anti-miR-214組細(xì)胞活力明顯降低，pre-scramble組和anti-scramble組細(xì)胞活力和正常對(duì)照組無(wú)差異。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示pre-miR-214組細(xì)胞PI值高于

11、正常對(duì)照組，anti-miR-214組細(xì)胞PI值低于正常對(duì)照組。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示pre-miR-214組PCNA、cyclinD1的表達(dá)高于正常對(duì)照組，anti-miR-214組則低于正常對(duì)照組。以上結(jié)果表明miR-214在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中可以促進(jìn)L6SKM增殖。
　　2、分化培養(yǎng)不同時(shí)間，L6SKM中miR-214、myo D、myogenin的表達(dá)
　　qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示隨著分化培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)miR-214、m

12、yo D、myogenin的表達(dá)均逐漸升高。
　　3、miR-214對(duì)分化培養(yǎng)不同時(shí)間L6SKM中miR-214、myo D、myogenin表達(dá)的影響
　　qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示pre-miR-214組miR-214、myo D、myogenin的表達(dá)均高于正常對(duì)照組和相應(yīng)時(shí)間的空白對(duì)照組，且隨著分化培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。anti-miR-214組miR-214、myo D、myogenin的表達(dá)則低于正常對(duì)照組和相應(yīng)時(shí)間

13、的空白對(duì)照組。說(shuō)明miR-214在分化培養(yǎng)基中可以促進(jìn)L6SKM分化。
　　4、H2O2對(duì)L6SKM的作用
　　MTT結(jié)果顯示L6SKM細(xì)胞活力隨H2O2濃度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴性。我們最終選取細(xì)胞存活率約為50％的H2O2作用濃度300μmol/L作用4h，建立氧化應(yīng)激模型。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，H2O2組中miR-214表達(dá)逐漸上升，且隨H2O2濃度和作用時(shí)間的增加而逐漸增加

14、。
　　5、miR-214對(duì)H2O2損傷L6SKM增殖和凋亡的作用
　　MTT結(jié)果顯示pre-miR-214+H2O2組L6SKM細(xì)胞活力和細(xì)胞存活率明顯高于H2O2組，anti-miR-214+H2O2組則低于H2O2組，前體空白組、抑制劑空白組和H2O2組無(wú)明顯差異。免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示pre-miR-214+H2O2組PCNA、cyclinD1的表達(dá)明顯高于H2O2組，anti-miR-214+H2O2組低于H

15、2O2組。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示pre-miR-214+H2O2組細(xì)胞PI值高于H2O2組，凋亡率低于H2O2組，而anti-miR-214+H2O2組PI值低于H2O2組，凋亡率高于H2O2組。Western blotting結(jié)果顯示pre-miR-214+H2O2組中caspase-3和BAX的表達(dá)明顯低于H2O2組，Bcl-2的表達(dá)明顯高于H2O2組。anti-miR-214+H2O2組caspase-3和BA

16、X的表達(dá)高于H2O2組，Bcl-2的表達(dá)低于H2O2組。前體空白組、抑制劑空白組和H2O2組無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、miR-214在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中可以促進(jìn)L6SKM增殖，在分化培養(yǎng)基中可以促進(jìn)L6SKM分化。
　　2、H2O2損傷可以使L6SKM中miR-214表達(dá)增加，且呈濃度和時(shí)間依賴性。
　　3、miR-214可以促進(jìn)氧化應(yīng)激損傷的成肌細(xì)胞增殖、增加存活率，抑制凋亡。miR-214通過(guò)抑制凋亡蛋白c