線粒體融合蛋白2對大鼠骨骼肌L6肌細胞GLUT4表達及轉(zhuǎn)位的影響.pdf

1、線粒體作為細胞能量代謝的核心，其結構和功能的改變與胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展密切相關。然而，線粒體缺陷是胰島素抵抗的原因，結果，還是其中的一個伴隨過程，目前仍有爭議。事實上，最早的關于線粒體功能與糖尿病之間相關性的研究是van den Ouweland JM等于1992年發(fā)現(xiàn)的線粒體DNA突變可導致母系遺傳性糖尿病。目前，關于二者相關性的眾多研究更傾向于線粒體功能的缺陷是繼發(fā)于胰島素抵抗而發(fā)生的，而非其始動因素。但是隨著線粒體氧化及磷酸化能

2、力的下降，胰島素抵抗的程度也隨之增加，因此可以推斷線粒體功能的缺陷是加劇胰島素抵抗的原因之一。
　　 線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）是位于線粒體外膜上的一種跨膜蛋白，它促進了線粒體的融合，并且參與了線粒體代謝的調(diào)節(jié)。其表達具有組織特異性，在骨骼肌、心肌及大腦等高能量代謝組織中高表達。近期的研究提示Mfn2在葡萄糖穩(wěn)態(tài)的維持中起到了重要的作用，此外，Mfn2表達的缺陷可能是胰島素抵抗發(fā)生的潛在病理生理機制之一

3、。研究發(fā)現(xiàn)，在Mfn2/shRNA BALB/c小鼠中，早期即出現(xiàn)胰島素抵抗，同時伴有肝葡萄糖生成增加。Sebastian D等發(fā)現(xiàn)Mfn2缺失可引起線粒體功能障礙，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成增加，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)活性增強，而胰島素信號通路的關鍵分子胰島素受體底物1（insulin receptor substrate-1，IRS

4、-1）失活。骨骼肌細胞中Mfn2功能的獲取增加了葡萄糖氧化率及線粒體膜電位，而線粒體膜電位的增加說明線粒體丙酮酸氧化作用的增強及三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的增強。最近，有學者提出在非糖尿病及糖尿病個體中Mfn2表達與胰島素敏感性之間存在著正相關關系。
　　 無論是在健康個體還是在2型糖尿病患者中，骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用在全身葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中都發(fā)揮了重要的作用。葡萄糖的攝取是葡萄糖代謝過程中的主要限速步驟，在骨骼肌中這一過程主要

5、由葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)完成。GLUT4是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族(GLUTs)中的一員，主要存在于骨骼肌和脂肪組織中。GLUT4表達減少或轉(zhuǎn)位障礙直接導致骨骼肌對葡萄糖的攝取障礙，最終導致高血糖。GLUT4的轉(zhuǎn)運主要是通過兩個獨立的信號途徑完成，一為胰島素依賴的信號途徑（PI3K-Akt途徑），另一條為非胰島素依賴的信號途徑(AMPK途徑)。研究發(fā)現(xiàn)全身葡萄糖的攝取與骨骼肌中GLUT4的表

6、達呈正相關關系。GLUT4的表達可通過調(diào)節(jié)GLUT4啟動子區(qū)的肌細胞增強子2（myocyte enhancer factor 2，MEF-2）來實現(xiàn)，其中組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)、過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator 1α, PGC-1α)及p38均可通過MEF-2來調(diào)節(jié)

7、GLUT4的表達。Sriwijitkamol A等報道在肥胖的胰島素抵抗大鼠中存在不同程度的AMPK-PGC-1α信號通路的異常，并且認為AMPK可能是通過PGC-1α誘導GLUT4蛋白表達。隨后Leick L等證實了這一觀點，研究發(fā)現(xiàn)AICAR干預(AMPK激動劑)可誘導野生型小鼠GLUT4蛋白表達增加，而在PGC-1α敲除小鼠中無此改變，進一步肯定了AMPK-PGC-1α途徑在調(diào)節(jié)GLUT4表達中的重要作用。
　　 最近在一

8、項關于糖尿病減肥手術的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，6名病態(tài)肥胖女性患者通過手術成功減重之后Mfn2 mRNA表達水平升高，同時伴有GLUT4mRNA表達上調(diào)及全身葡萄糖的攝取增加，并且Mfn2 mRNA與GLUT4mRNA表達存在正相關關系。然而Mfn2在葡萄糖攝取方面的更深入的研究目前尚未見報道。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食喂養(yǎng)所致胰島素抵抗的大鼠模型中骨骼肌Mfn2及GLUT4表達減低。國外亦有報道，在肥胖和2型糖尿病患者骨骼肌中同樣存在Mfn

9、2及GLUT4的表達減低，且兩者之間存在正相關關系。
　　 那么在整體動物模型中，Mfn2過表達能否抗衡病理條件，改善大鼠胰島素抵抗呢？本研究通過高脂飲食構建大鼠胰島素抵抗模型，觀察Mfn2腺病毒干預后對大鼠胰島素敏感性的變化及對骨骼肌GLUT4表達及轉(zhuǎn)運的影響;通過腺病毒轉(zhuǎn)染L6肌細胞，在細胞實驗中進一步驗證Mfn2對GLUT4表達及轉(zhuǎn)運的影響，進一步探討Mfn2影響GLUT4表達及轉(zhuǎn)運的具體機制。本實驗內(nèi)容主要包括以下三部分

10、:
　　 第一部分Mfn2對高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠骨骼肌GLUT4表達及轉(zhuǎn)運的影響
　　 目的:Mfn2過表達對高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠胰島素敏感性及骨骼肌GLUT4表達及轉(zhuǎn)運的影響
　　 方法:40只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組，正常對照組(NC，n=10)、高脂飲食組(HF，n=10)、高脂+空病毒組(HF+Ado，n=10)、高脂+ Mfn2腺病毒組(HF+AdMfn2，n=10)，

11、NC組給予普通飼料喂養(yǎng)，HF組、HF+Ado組及HF+組給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，實驗第8周末應用清醒狀態(tài)下高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗評價各組大鼠胰島素抵抗程度。實驗第9周開始，NC組、HF組、HF+Ado組及HF+AdMfn2組分別接受0.1ml生理鹽水、生理鹽水、Ado、AdMfn2經(jīng)尾靜脈注射，每周1次，共3周。病毒濃度為1×1010pfu/ml。實驗第11周末再次行高胰島素正葡萄糖鉗夾實驗評價各組大鼠胰島素抵抗程度。實驗結束前取血用于

12、生化指標的測定，之后處死各組大鼠，留取骨骼肌組織標本于-80℃低溫冰箱保存。實時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法檢測骨骼肌Mfn2及GLUT4 mRNA的表達。Western blot方法檢測骨骼肌Mfn2、胰島素受體β(IRβ)、磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）、p-AMPKα及GLUT4蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1、大鼠空腹

13、血糖、血清胰島素及游離脂肪酸的比較:高脂飲食干預11周后，大鼠空腹血葡萄糖、胰島素及游離脂肪酸水平HF組、HF+Ado組明顯高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); HF+AdMfn2組與NC組相比無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HF+Ado組與HF組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），HF+AdMfn2組明顯低于HF組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 2、大鼠葡萄糖輸注率(GIR)的

14、比較:高脂飲食喂養(yǎng)11周后，葡萄糖輸注率(GIR) HF組明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AdMfn2干預后GIR明顯增加，HF+AdMfn2組較HF組增加了67％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而HF+Ado組較HF組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3、Mfn2 mRNA和蛋白表達變化的比較:高脂飲食喂養(yǎng)11周后，HF組Mfn2mRNA和蛋白水平表達明顯下降，分別為NC組的51％

15、和44％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AdMfn2干預后，HF+AdMfn2組Mfn2 mRNA和蛋白水平分別為HF組的3.4和3.3倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而HF+Ado組較HF組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4、GLUT4 mRNA和蛋白表達變化的比較:高脂飲食喂養(yǎng)11周后，HF組GLUT4 mRNA和蛋白水平表達明顯下降，分別為NC組的56％和66％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0

16、.05)。AdMfn2干預后，HF+AdMfn2組GLUT4mRNA和蛋白水平分別為HF組的1.49和1.31倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而HF+Ado組較HF組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 5、AdMfn2干預對GLUT4轉(zhuǎn)位的影響:與NC組相比，HF組骨骼肌組織中膜蛋白與總蛋白比值(PM/T)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與HF組相比，AdMfn2干預后HF+AdMfn2組

17、PM/T比值為HF組的1.87倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;而這一比值在HF+Ado組和HF組中無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 6、AdMfn2誘導GLUT4轉(zhuǎn)位過程中Akt及AMPK信號通路蛋白表達的變化:與NC組相比，HF組IRβ、PI-3K、p-Akt和Akt蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而在HF組、HF+Ado組和HF+AdMfn2組中上述指標無明顯差異，差異無統(tǒng)計

18、學意義（P＞0.05）。與NC組相比，HF組p-AMPKα蛋白表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);HF+Ado組與HF組相比無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AdMfn2顯著增加了AMPKα的磷酸化水平，HF+AdMfn2組p-AMPKα蛋白表達水平為HF組的2.76倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但總的AMPKα蛋白表達水平各組間無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論:

19、r>　　 1、高脂飲食使大鼠空腹血糖、胰島素及游離脂肪酸水平升高，葡萄糖輸注率下降，導致胰島素抵抗，Mfn2過表達可改善高脂飲食誘導的大鼠胰島素抵抗。
　　 2、高脂飲食可使大鼠骨骼肌Mfn2表達下降，Mfn2過表達可使骨骼肌Mfn2表達上調(diào)。
　　 3、高脂飲食可使大鼠骨骼肌GLUT4的表達及轉(zhuǎn)位減少，Mfn2過表達可使骨骼肌GLUT4的表達及轉(zhuǎn)位上調(diào)。
　　 4、Mfn2過表達在增加GLUT4轉(zhuǎn)位的同時，伴

20、有AMPK磷酸化水平增加，而Akt磷酸化水平無明顯變化。Mfn2過表達可能通過AMPK磷酸化增加的方式增加了GLUT4的轉(zhuǎn)位，從而改善了胰島素敏感性。
　　 第二部分 Mfn2對L6肌細胞GLUT4表達的影響
　　 目的:通過腺病毒轉(zhuǎn)染siMfn2及AdMfn2干預L6肌細胞，觀察L6肌細胞GLUT4蛋白的表達情況，明確Mfn2表達對GLUT4蛋白表達的影響。
　　 方法:將L6細胞接種于含10％ FBS、100

21、U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2飽和培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，待細胞進入對數(shù)生長期后將含10％ FBS的培養(yǎng)基換成含2％FBS的培養(yǎng)基誘導細胞分化，共7天。分后成功后，實驗分為四組:
　　 ①正常對照組(NC group)；
　　 ②正常+空病毒組(Ado group)；
　　 ③正常+小干擾RNA病毒組(siMfn2 group)；
　　 ④正常+

22、Mfn2腺病毒組(AdMfn2 group)。
　　 L6肌細胞分化成功后，換用含0.5％ FBS的DMEM培養(yǎng)基，以100 pfu/cell(100MOI)的濃度分別加入Ado、siMfn2或AdMfn2轉(zhuǎn)染孵育24h，實驗結束前加入胰島素（終濃度為100nM）孵育10min，收集細胞用于實驗。應用Western blot方法檢測L6肌細胞Mfn2、AMPKα、p-AMPKα、PGC-1α及GLUT4蛋白的表達。
　　

23、 結果:
　　 1、siMfn2及AdMfn2干預對Mfn2蛋白表達影響的比較:siMfn2干預24小時后，L6肌細胞Mfn2蛋白水平明顯下降，siMfn2組約為NC組的13.9％，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AdMfn2干預24小時后，L6肌細胞Mfn2蛋白表達水平明顯增加，AdMfn2組約為NC組的2.61倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。為排除病毒轉(zhuǎn)染對細胞的影響，以空病毒作為對照，Ado組與NC組相比無明顯差異

24、，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AdMfn2組Mfn2蛋白表達水平較siMfn2組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、siMfn2及AdMfn2干預對p-AMPKα及AMPK蛋白表達影響的比較:siMfn2干預24小時后，L6肌細胞p-AMPKα蛋白水平明顯下降，siMfn2組約為NC組的61.1％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AdMfn2干預24小時后，L6肌細胞p-AMPKα蛋白表達水平明顯增加

25、，AdMfn2組約為NC組的1.49倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ado組與NC組相比無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AdMfn2組p-AMPKα蛋白水平較siMfn2組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各組間AMPKα蛋白表達無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3、siMfn2及AdMfn2干預對PGC-1α蛋白表達影響的比較:siMfn2干預24小時后，L6肌細胞PGC-1α

26、蛋白水平明顯下降，siMfn2組約為NC組的32.4％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AdMfn2干預24小時后，L6肌細胞PGC-1α蛋白表達水平明顯增加，AdMfn2組約為NC組的1.95倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ado組與NC組相比無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。AdMfn2組PGC-1α蛋白水平較siMfn2組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4、siMfn2及AdMfn2

27、干預對GLUT4蛋白表達影響的比較:siMfn2干預24小時后，L6肌細胞GLUT4蛋白水平明顯下降，siMfn2組約為NC組的54.5％，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。AdMfn2干預24小時后，L6肌細胞GLUT4蛋白表達水平明顯增加，AdMfn2組約為NC組的1.62倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ado組與NC組相比無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AdMfn2組GLUT4蛋白水平較siMfn2組明顯升高，

28、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論:在L6肌細胞中，上調(diào)Mfn2表達可使AMPK磷酸化水平增加，PGC-1α蛋白表達增加，GLUT4蛋白表達增加;下調(diào)Mfn2表達后，隨著Mfn2表達的下降，p-AMPK、PGC-1α及GLUT4的表達均隨之出現(xiàn)下調(diào)。
　　 第三部分 AMPK在Mfn2誘導的GLUT4表達及轉(zhuǎn)位中的作用
　　 目的:通過AdMfn2腺病毒轉(zhuǎn)染干預L6肌細胞，并加入compound C（

29、AMPK抑制劑），觀察L6肌細胞中GLUT4表達及轉(zhuǎn)位的變化，明確AMPK對GLUT4蛋白表達及轉(zhuǎn)位的影響。
　　 方法:將L6細胞接種子含10％ FBS、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5％CO2飽和培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2-3天傳代一次，待細胞進入對數(shù)生長期后將含10％ FBS的培養(yǎng)基換成含2％FBS的培養(yǎng)基誘導細胞分化，共7天。實驗分為四組:
　　 ①正常對照組(NC grou

30、p)；
　　 ②正常+Mfn2腺病毒組(AdMfn2 group)；
　　 ③正常+compound C組(CC group)；
　　 ④Mfn2腺病毒+compound C組(AdMfn2+ CC group)。
　　 L6肌細胞分化成功后，加入compound C10uM孵育30min，然后以100 pfu/cell(100 MOI)的濃度加入AdMfn2轉(zhuǎn)染孵育24h，實驗結束前加入胰島素（終濃度為

31、100nM）孵育10min，收集細胞用于實驗。應用Western blot方法檢測L6肌細胞Mfn2、AMPKα、p-AMPKα、Akt、p-Akt、PGC-1α及GLUT4蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1、AdMfn2及compound C干預對Mfn2蛋白表達影響的比較:AdMfn2干預24小時后，L6肌細胞Mfn2蛋白表達水平明顯增加，AdMfn2組約為NC組的3.0倍，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CC組

32、較NC組略有降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。compound C和AdMfn2共同干預后，AdMfn2+CC組較NC組相比Mfn2蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;但較AdMfn2組相比降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2、AdMfn2及compound C干預對p-AMPKα及AMPK蛋白表達影響的比較:AdMfn2干預24小時后，AdMfn2組較NC組相比p-AMPKα蛋白表達明顯增加

33、，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。compound C單獨干預及compound C加AdMfn2共同干預后，CC組和AdMfn2+CC組p-AMPKα蛋白表達水平較NC組降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;同樣低于AdMfn2組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而AdMfn2+CC組與CC組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組間AMPKα蛋白表達無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 3

34、、AdMfn2及Compound C干預對p-Akt及Akt蛋白表達影響的比較:各組間p-Akt及Akt蛋白表達均無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4、AdMfn2及Compound C干預對GLUT4轉(zhuǎn)位影響的比較:AdMfn2干預24小時后，AdMfn2組較NC組相比GLUT4膜蛋白的表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。compound C單獨干預及compound C加AdMfn2共同干

35、預后，CC組和AdMfn2+CC組GLUT4膜蛋白表達水平較NC組降低，并且也低于AdMfn2組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而AdMfn2+CC組與CC組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。AdMfn2干預24小時后，AdMfn2組較NC組相比GLUT4總蛋白的表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。compound C單獨干預及compound C加AdMfn2共同干預后，CC組和AdMfn2+CC組

36、GLUT4總蛋白表達較NC組降低，并且也低于AdMfn2組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而AdMfn2+CC組與CC組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。GLUT4膜蛋白與總蛋白的比值各組間無明顯差異，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 5、AdMfn2及compound C干預對PGC-1α蛋白表達影響的比較:AdMfn2干預24小時后，AdMfn2組較NC組相比PGC-1α蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)

37、計學意義(P＜0.05)。compound C單獨干預及compound C加AdMfn2共同干預后，CC組和AdMfn2+CC組PGC-1α蛋白表達水平較NC組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);同樣低于AdMfn2組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而AdMfn2+CC組與CC組相比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1.AdMfn2腺病毒轉(zhuǎn)染L6肌細胞可上調(diào)細胞Mfn2表達，加