乙醇降低大鼠心肌細(xì)胞AMPK和GLUT4的表達(dá).pdf

1、背景： 胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是肥胖等原因?qū)е碌臋C(jī)體對(duì)胰島素敏感性降低，從而引起組織細(xì)胞糖利用障礙和代謝紊亂。遺傳因素和環(huán)境因素均可誘導(dǎo)胰島素抵抗。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率逐漸增高，環(huán)境因素(如飲酒)對(duì)胰島素敏感性的影響逐漸引起人們廣泛的關(guān)注。 乙醇是目前濫用很廣的成癮物質(zhì)。長期過量攝入乙醇可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生多方面不利影響，如酒精性肝炎、酒精性心臟病、脂

2、肪肝等，而且與2型糖尿病發(fā)病率也呈明顯正相關(guān)。 目前，乙醇影響胰島素敏感性的具體機(jī)制尚未完全闡明。乙醇引起的胰島素抵抗伴有胰島素信號(hào)傳遞通路多個(gè)環(huán)節(jié)表達(dá)或活性的異常：胰島素受體(IR)，胰島素受體底物(IRS)或磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)活性下降，和/或胰島素與受體的結(jié)合能力降低等，這些均被認(rèn)為可致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(GLUT4)表達(dá)下降而誘導(dǎo)胰島素抵抗。然而僅用胰島素信號(hào)通路不能完全解釋乙醇誘導(dǎo)的胰島素敏感性降低，如胰島素信號(hào)通

3、路功能正常時(shí)，某些狀態(tài)下仍能檢測(cè)出組織GLUT4表達(dá)下降，葡萄糖攝取減少，胰島素敏感性明顯降低，提示存在獨(dú)立于胰島素信號(hào)通路以外的信號(hào)影響GLUT4的表達(dá)。 AMPK(AMP-activated Protein Kinase)，即AMP激活的蛋白激酶，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝的一種重要的調(diào)節(jié)因子。近幾年隨著對(duì)AMPK的研究，發(fā)現(xiàn)AMPK在調(diào)節(jié)代謝和維持能量平衡過程中，參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞GLUT4的糖轉(zhuǎn)運(yùn)，而且這一過程不需要胰島素信號(hào)

4、的介導(dǎo)。有資料表明，AMPK調(diào)節(jié)GLUT4的表達(dá)是通過肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2(Myocyte Enhancer Factor 2，MEF2)起作用的，磷酸化的AMPK能增加MEF2的基因表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)其蛋白水平的表達(dá)，增加GLUT4基因啟動(dòng)子上MEF2結(jié)合序列的活性，增加GLUT4的基因表達(dá)。5-氨基咪唑-4-氨基甲酰-1-β-D核糖呋喃腺苷(AICAR)足AMPK的特異性激活劑，已證實(shí)其在骨骼肌內(nèi)可激活A(yù)MPK并促進(jìn)葡萄糖的攝取，但其在心肌

5、內(nèi)是否發(fā)揮類似的作用，目前尚未見報(bào)道．乙醇降低骨骼肌和肝細(xì)胞AMPK的活性已有報(bào)道，但是乙醇是否影響心肌細(xì)胞中AMPK對(duì)GLUT4的調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的胰島素敏感性，目前未見有報(bào)道。 目的： 1．通過觀察AICAR對(duì)大鼠心肌MEF2及GLUT4表達(dá)量的影響，驗(yàn)證大鼠心肌組織中是否存在AMPK/MEF2/GLUT4通路。 2．通過觀察乙醇和AICAR刺激下，大鼠心肌細(xì)胞AMPKa和GLUT4的表達(dá)的變化，探討乙

6、醇影響心肌細(xì)胞胰島素敏感性的機(jī)制。 方法： 1) 動(dòng)物分組及處理：雄性Wistar大鼠，體重180-200g，隨機(jī)分為A組和C組，分別處理如下：A組分別皮下注射AICAR(0.8mg/g)，C組皮下注射相應(yīng)體積的生理鹽水。2小時(shí)后分別在冰上取心臟。采用RT-PCR分別檢測(cè)心肌組織MEF2A、MEF2D、GLUT4的mRNA水平。 2) 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)：取1～3天的Wistar大鼠，無菌條件下摘取心臟，在冰D-H

7、ank’s液中漂洗并剪碎心室組織，加入0.125％胰蛋白酶溶液，37℃水浴中消化4～6次，每次消化的上清液以新生牛血清終止消化，靜置后將各次上清液以1000r/min離心5min，棄去上清液后將細(xì)胞重懸于含20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，差速培養(yǎng)兩次，以1×105/ml的密度接種于培養(yǎng)板，置37℃、5~~C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)液并加入0.5μg/ml絲裂霉素抑制成纖維細(xì)胞生長，48h后棄去絲裂霉素，以后每2-3天換液一次

8、。用細(xì)胞免疫熒光方法鑒定心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞純度為95％左右。將培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為三組：乙醇處理組(E組)，AICAR處理組(A組)，正常對(duì)照組(C組)。E組給予終濃度100Mm的乙醇，A組給予終濃度1.0Mm的AICAR，C組正常換液。作用四小時(shí)后收集細(xì)胞，采用RT-PCR及Western Blot分別檢測(cè)GLUT4的mRNA水平及磷酸化AMPKα亞基(P-AMPKα)的蛋白水平。 結(jié)果： 1) AICAR對(duì)大鼠

9、心肌MEF2及GLUT4表達(dá)量的影響：RT-PCR結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，AICAR明顯上調(diào)MEF2A的mRNA水平，是對(duì)照組的4.9倍(P<0.01)；GLUT4的mRNA水平也相應(yīng)升高，是對(duì)照組的4.5倍(P<0.01)。然而，我們未檢測(cè)到有意義的MEF2D mRNA水平的變化，這與先前報(bào)道的心肌組織中MEF2A表達(dá)強(qiáng)而MEF2D表達(dá)弱相一致。 2) 乙醇及AICAR對(duì)心肌細(xì)胞P-AMPK表達(dá)的影響：Western Bl

10、ot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，乙醇處理組心肌細(xì)胞P-AMPKtt蛋白水平下降了61-38％(P<0.05)，而AICAR處理組其蛋白水平升高了74.74％(P<0.05)。 3) 乙醇及AICAR對(duì)心肌細(xì)胞GLUT4表達(dá)的影響：RT-PCR結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，乙醇處理組心肌細(xì)胞GLUT4的mRNA水平降低了30.43％(P<0.05)，而AICAR處理組GLUT4的mRNA水平升高了7.70％(P<0.05)。 結(jié)