乙醇降低大鼠心肌細胞AMPK和GLUT4的表達.pdf

1、背景： 胰島素抵抗(Insulin Resistance，IR)是肥胖等原因導致的機體對胰島素敏感性降低，從而引起組織細胞糖利用障礙和代謝紊亂。遺傳因素和環(huán)境因素均可誘導胰島素抵抗。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，2型糖尿病發(fā)病率逐漸增高，環(huán)境因素(如飲酒)對胰島素敏感性的影響逐漸引起人們廣泛的關注。 乙醇是目前濫用很廣的成癮物質。長期過量攝入乙醇可對機體產生多方面不利影響，如酒精性肝炎、酒精性心臟病、脂

2、肪肝等，而且與2型糖尿病發(fā)病率也呈明顯正相關。 目前，乙醇影響胰島素敏感性的具體機制尚未完全闡明。乙醇引起的胰島素抵抗伴有胰島素信號傳遞通路多個環(huán)節(jié)表達或活性的異常：胰島素受體(IR)，胰島素受體底物(IRS)或磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)活性下降，和/或胰島素與受體的結合能力降低等，這些均被認為可致葡萄糖轉運體4(GLUT4)表達下降而誘導胰島素抵抗。然而僅用胰島素信號通路不能完全解釋乙醇誘導的胰島素敏感性降低，如胰島素信號通

3、路功能正常時，某些狀態(tài)下仍能檢測出組織GLUT4表達下降，葡萄糖攝取減少，胰島素敏感性明顯降低，提示存在獨立于胰島素信號通路以外的信號影響GLUT4的表達。 AMPK(AMP-activated Protein Kinase)，即AMP激活的蛋白激酶，是哺乳動物細胞內糖脂代謝的一種重要的調節(jié)因子。近幾年隨著對AMPK的研究，發(fā)現AMPK在調節(jié)代謝和維持能量平衡過程中，參與了調節(jié)細胞GLUT4的糖轉運，而且這一過程不需要胰島素信號

4、的介導。有資料表明，AMPK調節(jié)GLUT4的表達是通過肌細胞增強因子2(Myocyte Enhancer Factor 2，MEF2)起作用的，磷酸化的AMPK能增加MEF2的基因表達，進而增強其蛋白水平的表達，增加GLUT4基因啟動子上MEF2結合序列的活性，增加GLUT4的基因表達。5-氨基咪唑-4-氨基甲酰-1-β-D核糖呋喃腺苷(AICAR)足AMPK的特異性激活劑，已證實其在骨骼肌內可激活AMPK并促進葡萄糖的攝取，但其在心肌

5、內是否發(fā)揮類似的作用，目前尚未見報道．乙醇降低骨骼肌和肝細胞AMPK的活性已有報道，但是乙醇是否影響心肌細胞中AMPK對GLUT4的調節(jié)，進而影響心肌細胞的胰島素敏感性，目前未見有報道。 目的： 1．通過觀察AICAR對大鼠心肌MEF2及GLUT4表達量的影響，驗證大鼠心肌組織中是否存在AMPK/MEF2/GLUT4通路。 2．通過觀察乙醇和AICAR刺激下，大鼠心肌細胞AMPKa和GLUT4的表達的變化，探討乙

6、醇影響心肌細胞胰島素敏感性的機制。 方法： 1) 動物分組及處理：雄性Wistar大鼠，體重180-200g，隨機分為A組和C組，分別處理如下：A組分別皮下注射AICAR(0.8mg/g)，C組皮下注射相應體積的生理鹽水。2小時后分別在冰上取心臟。采用RT-PCR分別檢測心肌組織MEF2A、MEF2D、GLUT4的mRNA水平。 2) 原代心肌細胞培養(yǎng)：取1～3天的Wistar大鼠，無菌條件下摘取心臟，在冰D-H

7、ank’s液中漂洗并剪碎心室組織，加入0.125％胰蛋白酶溶液，37℃水浴中消化4～6次，每次消化的上清液以新生牛血清終止消化，靜置后將各次上清液以1000r/min離心5min，棄去上清液后將細胞重懸于含20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，差速培養(yǎng)兩次，以1×105/ml的密度接種于培養(yǎng)板，置37℃、5~~C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后更換培養(yǎng)液并加入0.5μg/ml絲裂霉素抑制成纖維細胞生長，48h后棄去絲裂霉素，以后每2-3天換液一次

8、。用細胞免疫熒光方法鑒定心肌細胞，心肌細胞純度為95％左右。將培養(yǎng)的大鼠心肌細胞隨機分為三組：乙醇處理組(E組)，AICAR處理組(A組)，正常對照組(C組)。E組給予終濃度100Mm的乙醇，A組給予終濃度1.0Mm的AICAR，C組正常換液。作用四小時后收集細胞，采用RT-PCR及Western Blot分別檢測GLUT4的mRNA水平及磷酸化AMPKα亞基(P-AMPKα)的蛋白水平。 結果： 1) AICAR對大鼠

9、心肌MEF2及GLUT4表達量的影響：RT-PCR結果表明，與正常對照組相比，AICAR明顯上調MEF2A的mRNA水平，是對照組的4.9倍(P<0.01)；GLUT4的mRNA水平也相應升高，是對照組的4.5倍(P<0.01)。然而，我們未檢測到有意義的MEF2D mRNA水平的變化，這與先前報道的心肌組織中MEF2A表達強而MEF2D表達弱相一致。 2) 乙醇及AICAR對心肌細胞P-AMPK表達的影響：Western Bl

10、ot結果表明，與對照組相比，乙醇處理組心肌細胞P-AMPKtt蛋白水平下降了61-38％(P<0.05)，而AICAR處理組其蛋白水平升高了74.74％(P<0.05)。 3) 乙醇及AICAR對心肌細胞GLUT4表達的影響：RT-PCR結果表明，與正常對照組相比，乙醇處理組心肌細胞GLUT4的mRNA水平降低了30.43％(P<0.05)，而AICAR處理組GLUT4的mRNA水平升高了7.70％(P<0.05)。 結