C2C12GLUT4myc骨骼肌細胞株的建立及肌肉收縮調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)位的機制研究.pdf

1、胰島素和運動均促使葡萄糖轉(zhuǎn)運子4轉(zhuǎn)位到細胞膜上，轉(zhuǎn)運更多的葡萄糖進入細胞而調(diào)節(jié)細胞的葡萄糖攝取量。相對于胰島素，對運動/肌肉收縮刺激骨骼肌攝取葡萄糖的機制了解較少。
　　 目前研究運動/肌肉收縮多應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物，費用昂貴，而且不能應(yīng)用基因沉默等技術(shù)。而培養(yǎng)的細胞株則沒有諸多限制，可單獨分析細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，排除血液循環(huán)成分和血液動力學(xué)因素的影響，更好地理解鍛煉如何改善胰島素作用。目前廣泛應(yīng)用的L6骨骼肌細胞不具收縮能力。具收縮能力

2、的C2C12骨骼肌細胞僅表達少量的GLUT4，使得運動調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運的研究，因缺少合適的肌肉模型而受到限制。本研究的目的是建立C2C12GLUT4myc細胞株，并應(yīng)用此細胞模型探討運動/肌肉收縮刺激骨骼肌細胞GLUT4運輸?shù)臋C制。
　　 內(nèi)容和方法：
　　 第一部分建立C2C12GLUT4myc細胞株；檢測分化能力和GLUT4myc的表達量，確定分化能力強并高表達GLUT4myc的細胞株。與L6GLUT4myc比較膜蛋白

3、和信號分子以及GLUT1的表達；免疫熒光檢測GLUT4myc在細胞中的定位；測定此細胞響應(yīng)胰島素刺激的GLUT4轉(zhuǎn)位的時間曲線和劑量曲線。
　　 第二部分比較carbachol、AICAR和胰島素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位，并觀察三種刺激物作用的疊加性。通過使用各種信號蛋白的抑制劑，分析刺激GLUT4轉(zhuǎn)位的信號機制。
　　 第三部分比較三種刺激物對信號分子的作用，檢測信號分子的活性。<

4、br>　　 結(jié)果：
　　 建立了C2C12GLUT4myc細胞株，GLUT4myc的表達量與L6GLUT4myc中的GLUT4myc量接近，約為小鼠骨骼肌GLUT4的10倍。C2C12GLUT4myc細胞表達IRAP和TfR的量高于L6GLUT4myc，VAMP2和VAMP7的表達在兩種細胞中接近。C2C12GLUT4myc細胞表達AS160、AMPKα2和GLUT1高于L6GLUT4myc細胞，而Akt1和Akt2的表達則低

5、于L6GLUT4myc。兩種細胞表達AMPKα1、Akt3和PKC的量相近。GLUT4myc主要分布于細胞核周圍。C2C12GLUT4myc細胞的葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位對胰島素的作用呈劑量和時間依賴關(guān)系，最大值為基礎(chǔ)狀態(tài)的1.63±0.05倍。
　　 比較carbachol、AICAR和胰島素刺激的C2C12GLUT4myc肌管葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位，并觀察三種刺激物作用的疊加性的結(jié)果顯示，carbachol刺激葡萄糖攝

6、取和增加細胞表面GLUT4myc含量，使之分別增加為基礎(chǔ)組的1.604±0.08倍和1.774±0.08倍。胰島素使葡萄糖攝取和細胞膜上GLUT4myc分別增加1.55±0.02倍和1.63±0.05倍。AICAR使葡萄糖攝取和GLUT4轉(zhuǎn)位分別增加1.63±0.11倍和1.84±0.11倍。三種刺激物的作用均具有疊加性。胰島素和carbachol一起孵育使GLUT4myc細胞轉(zhuǎn)位增加2.57±0.30倍。胰島素和AICAR一起孵育使G

7、LUT4myc轉(zhuǎn)位增加2.80±0.30倍。Carbachol和AICAR一起孵育使GLUT4myc轉(zhuǎn)位增加2.95±0.38倍。LY294002不能抑制carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位，但此作用可被Compound C抑制85％。BTS可抑制57％的carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。Compound C抑制84％AICAR刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位，但不影響基礎(chǔ)和胰島素作用下的細胞膜上的GLUT4myc水平。B

8、IM和KN93均抑制carbachol刺激的GLUT4myc轉(zhuǎn)位。
　　 比較三種刺激物對信號分子的作用的結(jié)果顯示，carbachol和AICAR激活A(yù)MPK：Compound C抑制carbachol和AICAR刺激的AMPK磷酸化。carbachol不能誘導(dǎo)Akt的磷酸化，但增加Rab-GAP，AS160 Thr642的磷酸化。
　　 結(jié)論：
　　 1.可收縮的C2C12GLUT4myc骨骼肌細胞的GLUT4

9、myc轉(zhuǎn)位對胰島素作用呈劑量和時間依賴關(guān)系；細胞響應(yīng)carbachol刺激的收縮作用，GLUT4轉(zhuǎn)位到細胞膜并攝取葡萄糖。
　　 2.L6GLUT4myc和C2C12GLUT4myc骨骼肌細胞分別高表達胰島素關(guān)鍵信號分子Akt2和運動關(guān)鍵信號分子AMPKα2，提示此兩種細胞株可分別用于研究胰島素作用和運動/肌肉收縮作用的細胞模型。
　　 3.Carbachol去極化誘發(fā)的收縮刺激骨骼肌細胞GLUT4轉(zhuǎn)位和葡萄糖攝取，其信

10、號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制不同于胰島素和AICAR，參與的信號分子可能涉及LKB1、AMPK、CaMKⅡ和PKC。肌肉收縮可替代胰島素促進骨骼肌攝取葡萄糖。
　　 4.胰島素、AICAR和carbachol三種刺激物的信號途徑匯聚在AS160。
　　 本課題建立了可用于研究肌肉收縮刺激骨骼肌攝取葡萄糖機制的細胞模型，可用于篩查抗糖尿病藥物。并探討了收縮刺激GLUT4轉(zhuǎn)位的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，可為藥物研發(fā)提供作用靶點，并有助于臨床干預(yù)、改善胰島