蒲黃總黃酮對C2C12骨骼肌細胞葡萄糖代謝的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　2型糖尿病、代謝綜合征等多種代謝性疾病已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題之一，其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和病理生理學基礎是胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)，而IR發(fā)生的重要機制是胰島素信號通路的障礙，因此，提高胰島素信號通路的活性是防治IR的重要策略。除了經(jīng)典的磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)胰島素信號通路外，近年，科學家發(fā)現(xiàn)了一條新的胰島素信號

2、轉導通路，即β-arrestin 2依賴性信號通路。在胰島素刺激下，β-arrestin 2能募集Src和Akt到胰島素受體(Insulinreceptor，IR)，并結合形成一信號轉導復合物，從而調節(jié)胰島素介導的葡萄糖代謝效應。新的胰島素信號通路的發(fā)現(xiàn)將有助于進一步理解IR，也為防治IR相關性疾病提供了新的作用靶點。目前改善IR的代表藥物是噻唑烷二酮類(Thiazolidinediones，TZD)藥物，其作用機制是激動過氧化物酶增殖

3、活化受體-γ，提高PI3K信號通路的活性。盡管TZD已廣泛用于IR相關性疾病的防治，但也出現(xiàn)了一些副作用，如引起水鈉儲留，增加體重和體脂，并增加2型糖尿病患者心血管事件的風險，包括致死性心血管事件的發(fā)生。因此，尋找一種既能提高胰島素敏感性又不至于引起脂肪堆積，不增加心血管事件等不良反應的胰島素增敏劑是目前研究的一個重要方向。近年在臨床上，傳統(tǒng)的一種活血化瘀中藥--蒲黃常用于治療伴IR的2型糖尿病、代謝綜合征、肥胖等。在體外實驗中，課題組

4、前期工作發(fā)現(xiàn)蒲黃有效提取物蒲黃總黃酮(Pollen Typhae total flavones，PTF)能增加3T3L-1脂肪細胞依賴于胰島素的葡萄糖攝取和利用，減少脂肪細胞內脂質聚集，具有改善IR的潛在能力，但PTF缺乏系統(tǒng)的研究，其潛在分子機制也不清楚。
　　目的：
　　1.觀察PTF對C2C12骨骼肌細胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的影響，并了解這種效應與胰島素的關系；
　　2.觀察PTF對高濃度棕櫚酸和高糖高胰島素誘

5、導的IR模型細胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的影響；
　　3.從蛋白水平觀察PTF對PI3K信號通路和β-arrestin2依賴性信號通路相關信號分子蛋白表達的影響，探討PTF提高胰島素敏感性的分子機制；
　　4.從基因水平觀察PTF對β-arrestin2依賴性信號通路相關信號分子基因mRNA表達的影響，進一步探討PTF提高胰島素敏感性的分子機制。
　　方法：
　　1.二甲氧唑黃(XTT)比色法觀察PTF對C2C12

6、骨骼肌細胞活力的影響；
　　2.分別采用葡萄糖氧化酶法和氚標記的脫氧葡萄糖攝取法檢測C2C12骨骼肌細胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝?。?br>　　3.模擬IR患者體內脂質代謝紊亂及高血糖高胰島素水平的病理生理特點，以氚標記的脫氧葡萄糖攝取試驗為標準，分別采用高濃度棕櫚酸和高糖高胰島素孵育誘導C2C12骨骼肌細胞，建立瓜細胞模型；
　　4.免疫印跡法(Western Blot)法檢測PI3K信號通路和β-arrestin2依賴性信號

7、通路相關信號分子蛋白表達及其磷酸化水平；
　　5.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)法檢測β-arrestin2信號轉導復合物的形成，并用WesternBlot法鑒定復合物中蛋白分子；
　　6.ELISA法檢測PI3K活性；
　　7.Real-timePCR檢測基因β-arrestin2、Src和Akt2mRNA表達量。
　　結果：
　　1.PTF對C2C12骨骼肌細胞活力的影響

8、r>　　PTF干預C2C12骨骼肌細胞24小時，細胞活性與PTF濃度呈負相關。當PTF濃度在0.05-1.0g/L之間時，與對照組比較，細胞的活性無明顯的改變(P>0.05)；而當PTF濃度≥1.0g/L時，細胞的活性比對照組下降5.65％以上，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　2.PTF對C2C12骨骼肌細胞葡萄糖消耗的影響
　　以不同濃度的PTF(0.1g/L，0.25g/L，0.5g/L)分別孵育C2C12骨骼肌

9、細胞8h、16h、24h，PTF呈胰島素依賴性促進了C2C12骨骼肌細胞葡萄糖消耗。PTF干預8h，只有0.5g/L濃度點PTF呈胰島素依賴性提高了細胞的葡萄糖消耗量，比胰島素處理組升高了10.63％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PTF干預16h，0.25g/L和0.5g/L濃度點PTF都能促進細胞在胰島素處理下的葡萄糖消耗量，分別比胰島素處理組升高了10.62％和17.50％，差異明顯(P<0.05和P<0.01)；而干預24h

10、，3個濃度點PTF干預的細胞葡萄糖消耗量分別比胰島素處理組提高了11.60％，12.78％和16.23％，差異顯著(P<0.05、P<0.01和P<0.01)。
　　3.PTF對C2C12骨骼肌細胞葡萄糖攝取的影響
　　以不同濃度的PTF(0.1g/L，0.25g/L，0.5g/L)分別孵育C2C12骨骼肌細胞8h、16h、24h，PTF呈胰島素依賴性促進了C2C12骨骼肌細胞葡萄糖攝取。PTF干預8h，只有0.5g/L濃度

11、點PTF呈胰島素依賴性提高了細胞的葡萄糖攝取量，比胰島素處理組升高了14.79％，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PTF干預16h，0.25g/L和0.25g/L濃度點PTF都能促進細胞在胰島素處理下的葡萄糖攝取量，分別比胰島素處理組升高了20.52％和34.84％，差異顯著(P<0.01和P<0.01)；而PTF干預24h，3個濃度點PTF干預的細胞葡萄糖攝取量分別比胰島素處理組提高了12.29％，23.40％和30.31％，差異明顯(

12、P<0.05、P<0.01和.P<0.01)。
　　4.Wortmannin及PP2對PTF促進C2C12骨骼肌細胞葡萄糖攝取的影響
　　與胰島素處理組相比，5uM PI3K特異性抑制劑wortmannin干預C2C12骨骼肌細胞16h，能明顯抑制胰島素處理下細胞的葡萄糖攝取量(P<0.01)，但不能抑制PTF呈胰島素依賴性促進細胞對葡萄糖的攝取(P>0.05)；而5uM Src特異性阻斷劑PP2干預C2C12骨骼肌細胞16

13、h，也能顯著抑制胰島素處理下細胞的葡萄糖攝取量(P<4.01)，同時也明顯抑制PTF呈胰島素依賴性促進細胞對葡萄糖的攝取(P<0.01)。
　　5.IR細胞模型的建立
　　與正常胰島素處理組比較，以0.5mM棕櫚酸孵育C2C12骨骼肌細胞16h，細胞對依賴于胰島素的葡萄糖消耗量和葡萄糖攝取量分明別下降了19.29％和22.22％，差異明顯(P<0.01和P<0.01)；而以高糖(25mM)高胰島素(1μM)孵育C2C12骨骼

14、肌細胞16h，細胞對依賴于胰島素的葡萄糖攝取量明顯低于低糖(5mM)低胰島素(1nM)組(P<0.01)。
　　6.PTF對IR模型細胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的影響
　　以0.5g/LPTF和棕櫚酸共同孵育C2C12骨骼肌細胞16h，與棕櫚酸誘導的IR細胞相比，該細胞對依賴于胰島素的葡萄糖消耗量和葡萄糖攝取量均得以顯著提高(P<4.01和.P<0.01)，與正常胰島素處理組相類似(P>0.05)；同樣，0.5g/LPTF與高

15、糖高胰島素共同孵育C2C12骨骼肌細胞16h，幾乎可以逆轉由高糖高胰島素所誘導的葡萄糖攝取量下降(P<4.01)。
　　7.PTF對胰島素信號通路相關信號分子蛋白表達的影響
　　PTF干預C2C12骨骼肌細胞16h，能顯著提高細胞β-arrestin2、Src和Akt的蛋白表達，分別是對照組的1.65倍(P<0.01)、1.72倍(P<0.01)和1.24倍(P<0.05)，胰島素處理組的1.66倍(P<4.01)、1.67

16、倍(P<0.01)和1.49倍(P<0.01)；
　　PTF干預C2C12骨骼肌細胞16h，與胰島素處理組相比較，PTF能顯著提高胰島素刺激下InsRβ(Tyr1150/1151)、Src(Tyr416)、Akt(Thr308及Akt(Ser473)磷酸化水平(P<0.01)；
　　在胰島素刺激下，β-arrestin2募集Src、Akt并結合InsR形成一信號轉導復合物；PTF預先干預C2C12骨骼肌細胞16h，能顯著促進

17、該信號復合物的形成；
　　PTF干預C2C12骨骼肌細胞16h，細胞PI3K-p85蛋白表達和PI3K活性分別是對照組的1.02倍和1.07倍，胰島素處理組的1.10倍和1.03倍，均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　8.Wortmannin及PP2對PTF提高Akt磷酸化水平的影響
　　wortmannin干預C2C12骨骼肌細胞16h，能顯著抑制Akt(Thr308)和Akt(Ser473)磷酸化水平，分別比胰島

18、素處理組下降55.95％(P<0.01)和44.56％(P<0.01)；但PTF依賴于胰島素提高Akt(Thr308/Ser473)磷酸化水平的效應不被wortmannin所抑制(P>0.05)；
　　同樣，PP2干預C2C12骨骼肌細胞16h，也能顯著抑制Akt(Thr308)和Akt(Ser473)磷酸化水平，分別比胰島素處理組下降51.18％(P<0.01)和46.83％(P<0.01)；而PTF依賴于胰島素提高Akt(Th

19、r308)和Akt(Ser473)磷酸化水平的效應也被PP2所抑制，分別下降65.74％(P<0.01)和66.06％(P<0.01)。
　　9.PTF對胰島素信號通路相關信號分子基因表達的影響
　　PTF孵育C2C12骨骼肌細胞16h，能明顯提高基因Src和Akt2mRNA的表達，分別是對照組的1.18倍(P<0.05)和1.26倍(P<0.01)，但PTF對基因β-arrestin2mRNA的表達無明顯影響(P>0.05

20、)。
　　結論：
　　1.PTF在不降低細胞活力的情況下，呈胰島素依賴性提高C2C12骨骼肌細胞葡萄糖消耗和葡萄糖攝取。
　　2.PTF呈胰島素依賴性促進C2C12骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取受Sre阻斷劑PP2所抑制而不受PI3K抑制劑wortmannin所抑制。
　　3.高濃度棕櫚酸和高糖高胰島素都可以誘導C2C12骨骼肌細胞產(chǎn)生瓜。
　　4.PTF能夠逆轉分別由棕櫚酸、高糖高胰島素誘導C2C12骨骼肌細胞

21、所產(chǎn)生的IR。
　　5.PTF提高了C2C12骨骼肌細胞基因Src和Akt2mRNA的表達及β-arrestin2、Src和Akt蛋白表達。
　　6.PTF呈胰島素依賴性提高InsRβ(Tyr1150/1151)、Src(Tyr416)及Akt(Thr308/Ser473)磷酸化水平，并促進β-arrestin2募集Src和Akt并結合InsR形成信號轉導復合物。
　　7.PTF提高Akt(Thr308/Ser473)