亮氨酸對原代培養(yǎng)大鼠骨骼肌細胞葡萄糖攝取的影響及mTOR介導的相關機制研究.pdf

1、近年來，肥胖、糖尿病、代謝綜合癥等營養(yǎng)相關慢性病的發(fā)病呈逐年遞增的趨勢，已成為世界范圍內的流行病。而研究表明胰島素抵抗是上述疾病發(fā)病機制中的關鍵環(huán)節(jié)。胰島素抵抗與營養(yǎng)平衡失調密切相關，膳食營養(yǎng)干預成為改善胰島素抵抗、防治營養(yǎng)相關慢性病的重要措施。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸不僅僅是一種必需氨基酸，而且是一種重要的營養(yǎng)信號分子，參與了如調節(jié)蛋白質合成過程中翻譯的啟動、胰島素信號傳導、能量代謝等多種重要的生物學過程。尤其是亮氨酸在改善胰

2、島素抵抗方面的作用受到了越來越多的關注。最新的研究表明：亮氨酸可顯著改善高脂膳食引起的高血糖，改善脂肪細胞的胰島素抵抗。臨床上，對于肥胖、2 型糖尿病患者高亮氨酸膳食可以降低餐后血糖和胰島素水平，并有利于穩(wěn)定血糖水平和改善胰島素抵抗。但由于研究對象的差異，研究設計的不同，目前的研究結論不盡一致；而且亮氨酸影響胰島素敏感性的具體機制尚未闡明。
　　 骨骼肌是胰島素發(fā)揮效應的主要靶器官之一，負責餐后2/3以上的血糖利用，在胰島素抵抗

3、的發(fā)病中起重要作用。亮氨酸是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）最有效的激活劑。mTOR 包括兩種蛋白復合體，一種是對雷帕霉素敏感的mTORC1，一種是對雷帕霉素抵抗的mTORC2。mTORC1 可在不同的水平影響胰島素信號傳導途徑。蛋白激酶B（Protein Kinase B，PKB或AKT）作為胰島素信號傳導通路的下游分子，是胰島素發(fā)揮效應的關鍵分子。本實驗重在探討亮氨酸對原

4、代培養(yǎng)大鼠骨骼肌細胞葡萄糖攝取的影響，在此基礎上觀察不同阻斷劑作用后，亮氨酸對葡萄糖攝取的影響，同時檢測AKT、mTOR的蛋白表達水平及磷酸化水平，為研究亮氨酸與胰島素抵抗的關系和相關機制提供理論依據(jù)。本研究主要包括兩部分，現(xiàn)將結果報告如下：
　　 第一部分亮氨酸對原代培養(yǎng)大鼠骨骼肌細胞葡萄糖攝取的影響
　　 目的：以原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細胞為研究對象，觀察不同濃度亮氨酸作用不同時間對骨骼肌細胞葡萄糖攝取的影響，確定亮氨

5、酸作用的最佳濃度和時間。
　　 方法：組織塊法培養(yǎng)大鼠原代骨骼肌細胞，不同濃度的亮氨酸（0,0.4,2.0,4.0,8.0 mmol/l）作用80 min或45min，酶促級聯(lián)放大反應測定基礎狀態(tài)下和胰島素刺激下葡萄糖攝取能力。
　　 結果：基礎狀態(tài)下，亮氨酸對骨骼肌細胞的葡萄糖攝取無顯著影響；亮氨酸對骨骼肌細胞葡萄糖攝取的影響具有時間和劑量依賴性；胰島素刺激狀態(tài)下，在0～8 mmol/L 濃度范圍內，亮氨酸在2 mmo

6、l/L 時對葡萄糖攝取能力的影響達到最大。隨著作用時間的延長，亮氨酸增強葡萄糖攝取的能力顯著降低。2 mmol/L亮氨酸作用45min 骨骼肌細胞葡萄糖攝取能力達最大，顯著高于對照組（P<0.05）。
　　 結論：亮氨酸可顯著增強胰島素刺激下骨骼肌細胞的胰島素敏感性，并且這種作用與時間和劑量有關。
　　 第二部分亮氨酸影響骨骼肌細胞葡萄糖攝取能力的分子機制
　　 目的：渥曼青霉素(Wortmannin，PI-3K

7、 抑制劑)處理原代大鼠骨骼肌細胞，模擬胰島素抵抗，觀察亮氨酸對其葡萄糖攝取能力的影響；在此基礎上進一步應用mTOR 抑制劑雷帕霉素（Rapamycin），觀察葡萄糖攝取能力的變化；測定mTOR、AKT 總蛋白及磷酸化蛋白表達水平的改變，深入研究亮氨酸影響葡萄糖攝取能力的分子機制。
　　 方法：
　　 1．PI-3K 抑制劑Wortmannin 作用30 min，和/或mTOR 抑制劑Rapamycin 作用30 min，

8、2 mmol/L 亮氨酸和（或）胰島素干預45min 測定葡萄糖攝取能力。
　　 2．細胞經上述處理后，Western blot 檢測AKT 及pSer473 AKT表達水平，mTOR 及pSer2448 mTOR 蛋白表達水平。
　　 結果：
　　 1．胰島素刺激狀態(tài)下，Wortmannin 處理后骨骼肌細胞葡萄糖攝取能力顯著降低（P<0.05）。2mmol/L 亮氨酸干預，可顯著改善Wortmannin 對胰

9、島素刺激下骨骼肌細胞葡萄糖攝取的抑制作用（P<0.05），與不加亮氨酸相比，葡萄糖攝取增加了61％；Rapamycin 單獨作用后，骨骼肌細胞的葡萄糖攝取能力也顯著降低（P<0.05）,亮氨酸干預可顯著改善這種作用（P<0.05），與不加亮氨酸相比，葡萄糖攝取能力增加了71％ ；當Rapamycin與Wortmannin 聯(lián)合作用后，亮氨酸改善葡萄糖攝取的作用表現(xiàn)得不明顯（P>0.05），與不加亮氨酸相比，葡萄糖攝取能力增加了23％。<

10、br>　　 2．胰島素刺激狀態(tài)下，Wortmannin 處理后顯著降低骨骼肌細胞AKT Ser473位點的磷酸化水平（P<0.05）。2mmol/L 亮氨酸干預，可顯著改善Wortmannin 對胰島素刺激下骨骼肌細胞AKT Ser473 位點磷酸化的抑制作用（P<0.05），但對總的AKT表達沒有影響；Rapamycin 單獨作用對骨骼肌細胞pSer473 AKT的表達沒有顯著影響,亮氨酸干預效果不明顯；當Rapamycin與Wor

11、tmannin 聯(lián)合作用后，亮氨酸增強Wortmannin 處理后胰島素信號傳導關鍵分子pSer473AKT的表達的作用顯著降低（P<0.05）。
　　 3．Wortmannin 降低胰島素刺激下mTOR 及磷酸化mTOR 蛋白表達水平，但在亮氨酸干預后得到顯著改善（P<0.05）。當Rapamycin 聯(lián)合Wortmannin 處理后經亮氨酸干預，與單獨Wortmannin或Rapamycin 作用后亮氨酸干預相比mTOR、p

12、Ser2448 mTOR的蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。
　　 結論：亮氨酸可改善骨骼肌細胞胰島素抵抗；這種作用不完全依賴于PI-3K胰島素信號傳導通路，可能與其增強AKT 磷酸化水平有關；Rapamycin 可以抑制亮氨酸對Wortmannin 處理骨骼肌細胞葡萄糖攝取、AKT 蛋白磷酸化水平、mTOR、pSer2448 mTOR的蛋白表達水平的改善作用，提示mTORC1是亮氨酸改善胰島素抵抗的重要途徑；Wortman