Ghrelin對(duì)高脂環(huán)境下大鼠成肌細(xì)胞甘油三酯沉積及葡萄糖攝取的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、近年來(lái)，逐漸增多的肥胖和糖尿病帶來(lái)了很多并發(fā)癥，糖尿病和肥胖及其相關(guān)的胰島素抵抗、β細(xì)胞功能和免疫炎癥研究無(wú)疑成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。研究表明，血清游離脂肪酸(FFA)升高和甘油三脂在非脂肪組織（例如肝臟，肌肉和胰腺）的異位沉積與胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭相關(guān)。
　　肌肉是葡萄糖代謝的主要組織，大約75％胰島素刺激的葡萄糖吸收在肌肉進(jìn)行。很多研究都顯示IR和肌肉細(xì)胞內(nèi)的脂肪沉積密切相關(guān)。Perseghin等發(fā)現(xiàn)，肌細(xì)胞內(nèi)異常的脂質(zhì)

2、代謝和甘油三酯沉積與葡萄糖高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體的全身胰島素抵抗相關(guān)，其在2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制中可能起主要作用。
　　最近發(fā)現(xiàn)了一種新的多肽——生長(zhǎng)激素釋放肽(Ghrelin)，能刺激生長(zhǎng)激素(GH)的分泌，人們相繼研究發(fā)現(xiàn)它可以調(diào)節(jié)能量代謝、胃腸功能、抑制腫瘤細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能，并影響其他激素的釋放，已經(jīng)受到了很多學(xué)者的關(guān)注，成為代謝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin與胰島素抵抗及胰島素分泌調(diào)節(jié)有關(guān)，這提示我們Gh

3、relin與糖尿病的發(fā)病環(huán)節(jié)有一定相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)在許多外周組織細(xì)胞，Ghrelin通過(guò)與不同亞型的GHS-R結(jié)合并激活一系列信號(hào)傳導(dǎo)環(huán)節(jié)如AMPK途徑和Akt信號(hào)途徑而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化、脂質(zhì)代謝、抗炎癥反應(yīng)等作用。骨骼肌是周?chē)葝u素抵抗的主要靶位。但是，Ghrelin與骨骼肌胰島素抵抗的機(jī)制仍有待探討。Barazzoni等在給大鼠靜脈注入Ghrelin后，發(fā)現(xiàn)Ghrelin可使比目魚(yú)肌Akt通路活化、GLUT4 mRNA轉(zhuǎn)錄增加，提示

4、Ghrelin促進(jìn)骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高胰島素敏感性。Heijboer等研究發(fā)現(xiàn)給小鼠靜脈注入Ghrelin可促進(jìn)骨骼肌葡萄糖利用。以上研究均是動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，因此無(wú)法判斷是否通過(guò)其中樞作用所介導(dǎo)。最近有研究證實(shí)骨骼肌細(xì)胞膜表面存在Ghrelin的特異性結(jié)合位點(diǎn)，提示Ghrelin可能對(duì)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖代謝發(fā)揮直接作用，但是目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。
　　目的：
　　1、探討高脂環(huán)境對(duì)大鼠成肌細(xì)胞甘油三酯的含量及葡萄糖攝取的

5、影響；
　　2、探討Ghrelin對(duì)脂毒性作用下大鼠成肌細(xì)胞甘油三酯沉積及葡萄糖攝取的影響；
　　3、Ghrelin影響大鼠成肌細(xì)胞糖脂代謝的環(huán)節(jié)及發(fā)生機(jī)制。
　　方法：
　　三日齡wistar大鼠，提取大鼠成肌細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)，并行免疫組化鑒定。
　　應(yīng)用不同濃度棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞脂肪變性，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，油紅O染色方法顯示細(xì)胞內(nèi)甘油三酯沉積，GPO-POD酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量，

6、同位素示蹤法檢測(cè)細(xì)胞3氚標(biāo)記-2-脫氧-左旋-葡萄糖（2-dexoy-D-[3H]glucose）的攝取情況。以確定PA誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞脂肪變性的最佳濃度及時(shí)間。
　　應(yīng)用棕櫚酸(PA)誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞脂肪變性，應(yīng)用油紅O染色方法及GPO-POD酶法確定Ghrelin對(duì)高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細(xì)胞甘油三酯沉積的影響，應(yīng)用同位素示蹤法檢測(cè)Ghrelin對(duì)高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細(xì)胞3氚標(biāo)記-2-脫氧-左旋-葡萄糖（2-dexoy-D-[3H

7、]glucose）攝取的影響。
　　應(yīng)用RT-PCR及Western Blot方法，研究Ghrelin對(duì)高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細(xì)胞GLUT4、AMPK、ACC、UCP3 mRNA表達(dá)和蛋白水平的影響，從而研究Ghrelin對(duì)高脂狀態(tài)下的大鼠成肌細(xì)胞糖脂代謝影響的分子機(jī)制。
　　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):將所有數(shù)據(jù)輸入SPSS11.5。全部計(jì)量資料以mean±SD表示，多組間計(jì)量資料比較采用F檢驗(yàn)(One-Way ANOVA)，兩兩比較應(yīng)用q檢

8、驗(yàn)(S-N-K法)。P＜0.05判定為具有顯著性差異。
　　結(jié)果：
　　1、成肌細(xì)胞克隆樣梭形生長(zhǎng)，成肌細(xì)胞內(nèi)部可見(jiàn)多個(gè)核仁。免疫組化鑒定成肌細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性染色。
　　2、MTT比色法顯示隨著棕櫚酸(PA)處理濃度(0.1～0.5 mM)的增加，及暴露時(shí)間(6～24h)的增加，成肌細(xì)胞活力不斷降低，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴(lài)性的效應(yīng)關(guān)系。與對(duì)照組比較，PA濃度為0.1mM組細(xì)胞活力均不受影響，PA濃度為0.3 mM

9、，反應(yīng)時(shí)間6h及12h時(shí)細(xì)胞活力不受影響，PA濃度為0.3mM、反應(yīng)時(shí)間24小時(shí)及PA濃度為0.5mM組細(xì)胞活力均顯著下降(P＜0.01)。因此，PA誘導(dǎo)大鼠成肌細(xì)胞脂肪變性模型的反應(yīng)條件應(yīng)在細(xì)胞活力不受影響的組中選擇。
　　3、油紅O染色方法顯示正常培養(yǎng)的細(xì)胞（未加PA）中未見(jiàn)甘油三酯沉積。加入PA培養(yǎng)6h細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量脂肪變性細(xì)胞，脂滴數(shù)量較少，12h、24h脂變細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集了較多脂滴，部分脂滴融合。0.1m

10、M棕櫚酸PA組脂滴數(shù)量較少，隨PA濃度升高、脂滴沉積增加，但12和24小時(shí)無(wú)顯著差異。
　　4、GPO-POD酶法測(cè)定大鼠成肌細(xì)胞甘油三脂含量，與對(duì)照相比，0.1mM PA組及0.3mM PA6h組甘油三脂含量無(wú)明顯增加，甘油三酯含量隨PA濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加，12和24小時(shí)無(wú)顯著差異，即0.3mM PA12h、24h組和0.5mM PA組有明顯甘油三脂沉積(P＜0.01)。
　　5、同位素示蹤法檢測(cè)大鼠成肌細(xì)胞糖攝

11、取，隨PA濃度升高、作用時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠成肌細(xì)胞糖攝取減低，但12和24小時(shí)無(wú)顯著差異。0.1mM PA24h及0.3mMPA12h、24h及0.5mMPA12h、24h各組的大鼠成肌細(xì)胞糖攝取顯著減低(P＜0.01)。
　　6、加入0.3mmol/L PA培養(yǎng)12h（B組）可見(jiàn)脂變細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集了較多脂滴，部分脂滴融合。加Ghrelin干預(yù)組(C-E)脂滴數(shù)減少，隨Ghrelin濃度升高、脂滴沉積減少。
　　7、與正常對(duì)

12、照（A組）相比，高脂組及Ghrelin干預(yù)組各組成肌細(xì)胞中甘油三脂含量明顯增加(p＜0.01);與高脂組（B組）比較，10-9M、10-7M Ghrelin干預(yù)組（D、E組）成肌細(xì)胞中甘油三酯含量明顯減少(p＜0.05，p＜0.01);與10-11MGhrelin組（C組）比較，10-7MGhrelin干預(yù)組（E組）成肌細(xì)胞中甘油三酯含量明顯減少(p＜0.01)。
　　8、與正常對(duì)照（A組）相比，高脂組及10-11M Ghreli

13、n干預(yù)組（B、C組）成肌細(xì)胞糖攝取減低(p＜0.01，p＜0.05);與高脂組（B組）比較，Ghrelin干預(yù)各組（C-E組）成肌細(xì)胞糖攝取明顯增加(p＜0.05，p＜0.01);與10-11M Ghrelin組(C組)比較，10-7M Ghrelin干預(yù)組（E組）成肌細(xì)胞中糖攝取明顯增加(p＜0.05)。
　　9、與對(duì)照組相比，高脂組及干預(yù)組GLUT4、AMPK mRNA相對(duì)表達(dá)率、GLUT4蛋白相對(duì)水平均無(wú)明顯改變，
　

14、　10、與對(duì)照組相比，0.3mM PA組和10-9M、10-11M Ghrelin干預(yù)組的UCP3mRNA相對(duì)表達(dá)率明顯降低(p＜0.01)，10-7M Ghrelin干預(yù)組無(wú)顯著差異;與0.3mM PA組相比，Ghrelin干預(yù)各組UCP3mRNA相對(duì)表達(dá)率均顯著升高(p＜0.05);Ghrelin干預(yù)各組之間無(wú)顯著差異。
　　11、與對(duì)照組相比，0.3mM PA組和10-11M Ghrelin干預(yù)組的p-AMPKα/AMPKα

15、相對(duì)蛋白水平明顯降低(p＜0.01)，10-7M、10-9M Ghrelin干預(yù)組無(wú)顯著差異;與0.3mM PA組相比，Ghrelin干預(yù)各組p-AMPKα/AMPKα相對(duì)蛋白水平均顯著升高(p＜0.05，p＜0.01);10-7M Ghrelin干預(yù)組顯著高于10-11M Ghrelin干預(yù)組(p＜0.05)。
　　12、與對(duì)照組相比，0.3mM PA組和Ghrelin干預(yù)各組UCP3相對(duì)蛋白水平均明顯降低(p＜0.05，p＜0

16、.01);與0.3mM PA組相比，10-11M Ghrelin干預(yù)組無(wú)明顯變化，10-9M、10-7M Ghrelin干預(yù)組顯著升高(p＜0.05，p＜0.01);與10-11MGhrelin干預(yù)組相比，10-9M、10-7M Ghrelin干預(yù)組顯著升高(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1、棕櫚酸(PA)可以作用于大鼠成肌細(xì)胞，使其脂肪沉積，甘油三酯含量增加，糖攝取減少，并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　2、PA誘導(dǎo)大鼠成

17、肌細(xì)胞脂肪變性的最佳濃度0.3mmol/L，最佳反應(yīng)時(shí)間12h（H組），此時(shí)細(xì)胞活力不受影響，并且細(xì)胞中有明顯的甘油三酯沉積，細(xì)胞的糖攝取顯著減低。
　　3、Ghrelin可減少大鼠成肌細(xì)胞的甘油三酯沉積，可增加高脂環(huán)境下大鼠成肌細(xì)胞的糖攝取，并且存在劑量依賴(lài)關(guān)系。
　　4、本研究證實(shí)在非胰島素存在時(shí)Ghrelin通過(guò)刺激AMPK通路直接促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，并且通過(guò)刺激AMPK磷酸化，促進(jìn)UCP3活化及ACC磷酸化，從而促進(jìn)大鼠