蝙蝠葛酚性堿對原代培養(yǎng)大鼠皮層細(xì)胞及離體腦片氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究通過建立原代培養(yǎng)大鼠皮層細(xì)胞和離體腦片氧糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模型,觀察蝙蝠葛酚性堿(Phenolic alkaloids from Menispermum dauricum rhizome,PAM)在離體水平對OGD損傷的保護(hù)作用,并從細(xì)胞外谷氨酸(Glutamate,Glu)含量、細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、線粒體膜電位(Mito

2、chondrial membrane potential,MMP)及相關(guān)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(Excitatory amino acid transporters,EAATs)的表達(dá)等方面,探討PAM對抗OGD損傷的保護(hù)作用及機(jī)制,為缺血性腦損傷相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn),同時(shí)也為其臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法和結(jié)果：
　　第一部分蝙蝠葛酚性堿對原代培養(yǎng)大鼠皮層細(xì)胞氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　離體腦缺

3、血模型采用原代培養(yǎng)大鼠皮層細(xì)胞的OGD模型。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PAM的給藥劑量和給藥時(shí)間段。通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT]比色法和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)檢測來觀察PAM對OGD復(fù)氧(OGD-reoxygenation,OGD-R)所致大鼠皮層

4、細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)熒光檢測技術(shù)測定原代培養(yǎng)大鼠皮層細(xì)胞培養(yǎng)液中Glu的含量。分別利用二氯二氫熒光素二乙酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針和陽離子熒光羰花青染色劑(5,5’,6,6’,-tetrachloro-1,1’,3,3’tetraethylbenzimidaz

5、o1carbocyanine iodide,JC-1),運(yùn)用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)ROS和MMP的檢測,以期進(jìn)一步探討PAM的保護(hù)作用機(jī)制。
　　根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇PAM(0.1,1,10μg/mL)三個(gè)劑量進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn),給藥時(shí)間點(diǎn)選在開始OGD時(shí)給藥并持續(xù)至復(fù)氧結(jié)束。結(jié)果顯示,PAM可以減輕OGD-R對大鼠皮層細(xì)胞的損傷。PAM可以有效降低OGD后細(xì)胞外液Glu含量的增加,在復(fù)氧6h后減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及降低MMP去極化程度

6、。
　　第二部分蝙蝠葛酚性堿對大鼠離體腦片氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　大鼠離體腦片缺血模型采用OGD模型。通過2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色的方法檢驗(yàn)PAM對離體腦片的保護(hù)作用。分別檢測皮層腦片和海馬腦片上EAATs中的膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Glial glutamate transporter-1,GLT-1)和興奮性氨基酸載體

7、1(Excitatory amino acid carrier1,EAAC1)的蛋白表達(dá)來探討PAM對OGD-R損傷的保護(hù)機(jī)制。
　　結(jié)果顯示,PAM(0.3,3,30μg/mL)可以有效減輕OGD-R對大鼠離體腦片的損傷。OGD-R可使皮層腦片和海馬腦片的GLT-1表達(dá)下降,EAAC1表達(dá)升高。而PAM除了在海馬腦片上對EAAC1無顯著影響之外,均可有效逆轉(zhuǎn)OGD-R對這兩種EAATs的影響。
　　結(jié)論:PAM在離體水平下