自噬在原代培養(yǎng)神經(jīng)元氧糖剝奪再灌注模型中的保護(hù)作用.pdf_第1頁(yè)
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1、腦卒中,是一類病理機(jī)制復(fù)雜,由腦部血供障礙引起腦血管疾病并且目前尚無有效臨床治療手段。自噬是細(xì)胞通過溶酶體機(jī)制對(duì)胞內(nèi)成分的分解代謝過程。雖有證據(jù)表明腦缺血過程中伴隨自噬現(xiàn)象,然而它在缺血性腦損傷中的作用及其調(diào)控機(jī)制均不清楚。
  目的:利用小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元氧糖剝奪再灌(Oxygen-glucosedeprivation/Reperfusion,OGD/Rep)模型,明確自噬在缺血性腦損傷中的作用;初步探索Bnip3L(NIX

2、)是否參與腦缺血再灌注誘導(dǎo)的線粒體自噬。
  方法:[1]關(guān)于自噬在原代培養(yǎng)神經(jīng)元OGD/Rep.中作用的研究:(1)在小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元OGD/Rep.實(shí)驗(yàn)中,于再灌0,1,3,6,12,24 h后用Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ和p62/SQSTM1(p62)的蛋白水平,并且對(duì)不同再灌時(shí)間的神經(jīng)元自噬泡數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。(2)于OGD2 h后的復(fù)灌過程中給予神經(jīng)元自噬抑制劑3-MA(或自噬誘導(dǎo)劑Rapamycin)和巴

3、弗洛霉素A1,復(fù)灌24 h后采用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率。另外,利用siRNA技術(shù)干擾了自噬相關(guān)基因Atg7的表達(dá),同樣在復(fù)灌24 h后采用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率,并利用Western blot檢測(cè)Caspase-3的方法檢測(cè)凋亡水平。(3)于OGD復(fù)灌過程中給予神經(jīng)元自噬抑制劑3-MA:神經(jīng)元OGD/Rep.實(shí)驗(yàn)中,在復(fù)灌1,3,6h后細(xì)胞線粒體和自噬泡分別用Mitotracker Red和LC3免疫染色標(biāo)記,并定量?jī)烧叩闹睾铣潭取T趶?fù)灌6

4、h后采用定量PCR技術(shù)利用線粒體DNA編碼基因ATPase6與基因組DNA編碼基因Rpl13之比表征單位細(xì)胞/組織內(nèi)的線粒體數(shù)量。利用siRNA技術(shù)干擾Atg7的表達(dá),分離出線粒體蛋白部分和胞漿蛋白部分并利用Western blot檢測(cè)線粒體自噬水平以及凋亡水平。[2]探索Nix是否參與OGD/Rep.過程中的線粒體自噬的研究:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組:BALB/CbYj野生型組(Nix+/+),雜合子組(Nix+/-),純合子組(Nix-/-

5、)。對(duì)各組小鼠施行局灶性腦缺血(MCAO)手術(shù),60 min后再灌。于再灌6h后用Western blot檢測(cè)缺血半暗帶腦組織線粒體自噬水平。
  結(jié)果:[1]在神經(jīng)元OGD/Rep.過程中,自噬被逐漸激活。[2]抑制自噬加重OGD/Rep.誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷以及細(xì)胞凋亡。[3]神經(jīng)元OGD/Rep.誘導(dǎo)自噬依賴的線粒體清除。[4]抑制線粒體自噬進(jìn)一步上調(diào)了細(xì)胞色素C釋放。[5] Nix基因敲除小鼠的線粒體自噬水平在腦缺血再灌注過程中

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