間斷多次低溫對(duì)糖氧剝奪神經(jīng)元的保護(hù)作用.pdf

1、神經(jīng)保護(hù)劑的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人類臨床試驗(yàn)結(jié)果差異較大。很多神經(jīng)保護(hù)劑在各種動(dòng)物缺血性模型中被證明有效，但是沒(méi)有一個(gè)在人類Ⅲ期臨床試驗(yàn)有作用。通過(guò)回顧性分析人類神經(jīng)保護(hù)劑的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)(RCT)探討神經(jīng)保護(hù)劑臨床轉(zhuǎn)化失敗的原因，我們發(fā)現(xiàn)很多因素與之相關(guān):模型選擇，麻醉劑選擇，生理學(xué)指標(biāo)監(jiān)測(cè)，造模成功標(biāo)準(zhǔn)，栓子性質(zhì)，再灌注損傷，梗死面積，治療時(shí)間窗，藥物滲透性，血藥濃度，性別差異，結(jié)果評(píng)估等。而入院前“家庭藥物”超早期治療和多靶點(diǎn)治療或許是未來(lái)考

2、慮的方向。
　　 低溫可以通過(guò)多靶點(diǎn)抑制缺血后損傷通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。頸動(dòng)脈內(nèi)冰鹽水灌注(ICSI)是最快速的低溫誘導(dǎo)方式。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，在大鼠缺血性卒中模型中低溫的治療時(shí)間窗比血管沖洗的作用時(shí)間寬。然而持續(xù)大量的ICSI來(lái)維持局部腦低溫會(huì)導(dǎo)致病人一些列的副作用。因此我們考慮將這種特殊的治療方法應(yīng)用于未來(lái)臨床時(shí)，我們意識(shí)到，為了在治療效果和減少持續(xù)ICSI大容量鹽水灌注的副作用方面權(quán)衡利弊，我們將其改良為間斷ICSI。

3、我們近期研究發(fā)現(xiàn)，與持續(xù)ICSI相比，間斷策略可以維持更長(zhǎng)時(shí)間的低溫，對(duì)血細(xì)胞比容影響更小，可能為一種更有潛力的神經(jīng)保護(hù)手段。
　　 雖然前期研究顯示間斷多次低溫對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈梗死(MCAO)模型有治療效果。間斷低溫的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制仍不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)利用胎鼠皮層神經(jīng)元糖氧剝奪模型來(lái)體外模擬缺血性卒中，利用細(xì)胞模型高通量的特點(diǎn)比較不同低溫模式對(duì)神經(jīng)損害機(jī)制的影響，探討間斷多次低溫可能的神經(jīng)保護(hù)靶點(diǎn)。為篩選最優(yōu)的間斷低溫模式以及未

4、來(lái)臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 第一章皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)
　　 胎鼠皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)可以制作多種神經(jīng)疾病的體外細(xì)胞模型。但是胎鼠腦體積較小，解剖難度相對(duì)較大，皮層神經(jīng)元急性分離和培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)復(fù)雜，至今尚未有統(tǒng)一的操作路徑。因此探討一種簡(jiǎn)便，合理，可重復(fù)性好的操作方法對(duì)于研究細(xì)胞模型至關(guān)重要。
　　 首先脫頸處死SPF級(jí)E18SD孕鼠，取出子宮和胎鼠。為了減少神經(jīng)元代謝，保證其活力，接下來(lái)的解剖過(guò)程在碎冰上進(jìn)行。

5、我們將傳統(tǒng)的斷頭后分離解剖頂端皮層改良為經(jīng)鼻入路雙側(cè)對(duì)稱分離法進(jìn)行解剖，縮短了胎鼠皮層的解剖時(shí)間。然后用體視鏡顯微剝離皮層腦膜和血管，以減少腦膜細(xì)胞和血管細(xì)胞等混雜細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元純度的干擾。由于這個(gè)過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，顯微解剖在含有10％胎牛血清(FBS)和谷氨酰胺的HG-DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中進(jìn)行以確保解剖過(guò)程中神經(jīng)元的能量代謝。將剝離干凈的胎鼠腦皮層置入含有冰HG-DMEM（不含F(xiàn)BS）的一次性3.5 cm滅菌培養(yǎng)皿中，用滅菌的顯微解剖剪

6、剪碎至約1mm。考慮到傳統(tǒng)的胰酶消化速度不好控制，我們用木瓜酶結(jié)合DNA酶Ⅰ序貫消化。終止消化后，經(jīng)過(guò)巴氏管吹打和細(xì)胞篩過(guò)濾得到神經(jīng)元的單細(xì)胞懸液，用0.2％錐蟲(chóng)藍(lán)染色以確保細(xì)胞團(tuán)塊要少于10％，死細(xì)胞數(shù)量小于1％。用0.1mg/ml左旋多聚賴氨酸預(yù)包被過(guò)的培養(yǎng)瓶以50000/cm2的密度接種神經(jīng)元，4小時(shí)后發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁。用neurobasal+B27+谷氨酰胺+青鏈雙抗的培養(yǎng)液換液后繼續(xù)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的神經(jīng)元通過(guò)DAPI染核

7、，B-3-TUBULIN骨架蛋白免疫熒光鑒定。神經(jīng)元純度通過(guò)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀測(cè)量均提示大于95％，可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需要。
　　 第二章糖氧剝奪模型制作及低溫干預(yù)方案
　　 缺血性卒中發(fā)生時(shí)，血液供應(yīng)減少導(dǎo)致病灶區(qū)營(yíng)養(yǎng)和氧氣相應(yīng)剝奪。這是形成“核心”梗死灶和缺血半暗帶的重要原因。而這一過(guò)程可以用體外細(xì)胞卒中模型來(lái)進(jìn)行模擬。核心梗死灶中已經(jīng)死亡的神經(jīng)元沒(méi)有研究?jī)r(jià)值，而位于缺血半暗帶的神經(jīng)元是我們體外卒中模型研究的重

8、點(diǎn)。越接近核心梗死灶，糖氧剝奪程度越重，而缺血半暗帶區(qū)糖氧剝奪程度相對(duì)較輕。因此我們可以通過(guò)精確控制神經(jīng)元培養(yǎng)液中的“糖”等營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)模擬糖剝奪。也可以通過(guò)厭氧培養(yǎng)箱來(lái)控制神經(jīng)元培養(yǎng)環(huán)境中的“氧”濃度來(lái)模擬氧剝奪。相應(yīng)的，如果缺血性卒中后期，責(zé)任血管發(fā)生再通或者是側(cè)支循環(huán)建立恢復(fù)供血，又會(huì)面臨著缺血再灌注損傷。而在體外細(xì)胞模型我們可以通過(guò)重新恢復(fù)神經(jīng)元培養(yǎng)液和氧供給來(lái)研究這一重要的病理生理過(guò)程。
　　 本實(shí)驗(yàn)在神經(jīng)元糖氧剝奪模型

9、的基礎(chǔ)上實(shí)施間斷多次低溫干預(yù)，具體方案為:糖剝奪用磷酸鹽緩沖液(PBS)置換培養(yǎng)液，氧剝奪用厭氧培養(yǎng)手套箱進(jìn)行（氧含量小于1％），糖氧剝奪時(shí)間為90分鐘。低溫干預(yù)包括持續(xù)低溫組(CH)和間斷多次低溫組(IH)。低溫組由33℃細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，USA)中進(jìn)行，常溫組設(shè)定為37℃（均為含5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱）。持續(xù)低溫1組(CH1)的低溫時(shí)長(zhǎng)為6小時(shí)（與其他間斷多次低溫組的低溫時(shí)間之和相同）。持續(xù)低溫2組(CH2)的低溫時(shí)長(zhǎng)為12

10、小時(shí)（與其他間斷多次低溫組的總時(shí)長(zhǎng)相同）。間斷低溫1組(IH1)是1小時(shí)低溫間隔1小時(shí)常溫。間斷低溫2組(IH2)的低溫間斷周期為1.5小時(shí)。間斷低溫3組(IH3)的間斷周期為2小時(shí)，觀察指標(biāo)的終點(diǎn)為低溫干預(yù)后的48小時(shí)。同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組與糖氧剝奪(OGD)對(duì)照組。低溫干預(yù)后我們接下來(lái)從各個(gè)角度評(píng)估其作用。
　　 第三章間斷多次低溫對(duì)糖氧剝奪神經(jīng)元的保護(hù)作用
　　 本章旨在探討間斷多次低溫對(duì)糖氧剝奪后神經(jīng)元可能的保護(hù)靶

11、點(diǎn)，以及比較持續(xù)低溫和間斷低溫對(duì)其損傷抑制作用的不同特點(diǎn)。本章按照第一章方法原代培養(yǎng)胎鼠皮層神經(jīng)元，然后按照第二章的方法制作糖氧剝奪模型以及實(shí)施低溫干預(yù)。截至終點(diǎn)時(shí)觀察各項(xiàng)指標(biāo)。首先從宏觀的角度比較各個(gè)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。然后通過(guò)神經(jīng)元微環(huán)境代謝的角度，比較各組細(xì)胞活力的變化，檢測(cè)細(xì)胞損傷釋放入上清的酶標(biāo)記物（神經(jīng)元微管蛋白-2）以及興奮性氨基酸（谷氨酸及其氧化酶）。接下來(lái)探測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化損傷，酸中毒，鈣超載，線粒體去極化等，探討間斷多次低

12、溫對(duì)糖氧剝奪后神經(jīng)元是否具有保護(hù)作用以及其可能的機(jī)制。
　　 首先我們對(duì)各組間神經(jīng)元形態(tài)學(xué)進(jìn)行比較，正常組的神經(jīng)元折光性強(qiáng)，胞體呈立體狀，軸突生長(zhǎng)旺盛，且與周圍神經(jīng)元相互聯(lián)系呈網(wǎng)絡(luò)狀。而OGD組的神經(jīng)元密度明顯下降，神經(jīng)元大量死亡漂浮導(dǎo)致數(shù)量明顯減少。軸突崩解，華勒變性嚴(yán)重。而OGD后低溫干預(yù)各組的神經(jīng)元形態(tài)均恢復(fù)良好，僅有少量軸突斷裂，與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并不明顯。由于單純從神經(jīng)元形態(tài)學(xué)判斷低溫的效果并不可靠，有些

13、貌似“正?！钡纳窠?jīng)元微觀已經(jīng)發(fā)生了變化，接下來(lái)我們將從不同角度探索間斷多次低溫可能的作用。
　　 從神經(jīng)元活力的角度上看，我們用Cell counting kit-8試劑盒(CCK-8)檢測(cè)各組間神經(jīng)元活力，結(jié)果顯示CCK-8正常組(0.2984±0.0017)，OGD組(0.2205±0.0215), CH1組(0.2617±0.0015), CH2組(0.2535±0.0052), IH1組(0.2329±0.0026)，I

14、H2組(0.2724±0.0033)，IH3組(0.2814±0.0025)。統(tǒng)計(jì)分析后提示與正常對(duì)照組相比，糖氧剝奪后神經(jīng)元活力下降。在持續(xù)低溫組中，6小時(shí)持續(xù)低溫與12小時(shí)持續(xù)低溫均有助于恢復(fù)糖氧剝奪后神經(jīng)元活力，其中6小時(shí)持續(xù)低溫效果好于12小時(shí)持續(xù)低溫。在間斷低溫組中，1小時(shí)間斷低溫雖然有活力恢復(fù)的趨勢(shì)，但并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.5小時(shí)和2小時(shí)間斷低溫均有助于恢復(fù)糖氧剝奪后神經(jīng)元活力，其中2小時(shí)間斷低溫效果優(yōu)于1.5小時(shí)間斷低溫

15、。間斷低溫與持續(xù)低溫相比，1.5小時(shí)和2小時(shí)間斷低溫效果均優(yōu)于持續(xù)低溫組，其中2小時(shí)間斷低溫效果最佳。
　　 從神經(jīng)元酶損傷標(biāo)記物的角度上看，我們用大鼠神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒來(lái)檢測(cè)上清中的MAP-2。結(jié)果顯示正常組(1.0780±0.1366),OGD組(1.3461±0.0966), CH1組(1.1858±0.0881),CH2組(1.2893±0.0747), IH1組(1.3

16、251±0.0616), IH2組(1.3325±0.1618),IH3組(1.1808±0.1593)。統(tǒng)計(jì)分析后提示糖氧剝奪后神經(jīng)元微環(huán)境中的MAP-2含量增加。在持續(xù)低溫組中，6小時(shí)持續(xù)低溫可以抑制糖氧剝奪后MAP-2的釋放，12小時(shí)持續(xù)低溫有下降的趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在間斷低溫組中，2小時(shí)間斷低溫可以抑制糖氧剝奪后MAP-2的釋放，1小時(shí)和1.5小時(shí)間斷低溫有下降的趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。間斷低溫與持續(xù)低溫相比，2小時(shí)間斷低溫

17、和6小時(shí)持續(xù)低溫對(duì)減少OGD后MAP-2釋放的效果相當(dāng)。
　　 從興奮性氨基酸谷氨酸及其氧化酶的角度上看，我們用Amplex(@) Red谷氨酸/谷氨酸氧化酶試劑盒檢測(cè)各組間神經(jīng)元上清中谷氨酸和谷氨酸氧化酶活性。結(jié)果顯示正常組(2698.91±206.74)，OGD組(2719.35±195.53)，CH1組(2763.77±227.90), CH2組(2703.73±278.95),IH1組(2697.83±203.14),

18、IH2組(2714.32±195.63)，IH3組(2653.49±230.16)。谷氨酸氧化酶正常組(478.62±52.08)，OGD組(490.14±70.19), CH1組(494.33±92.01),CH2組(450.42±54.26),IH1組(462.52±95.59),IH2組(468.53±33.50),IH3組(455.95±46.10)。統(tǒng)計(jì)顯示，各組間數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)分析原因，我們發(fā)現(xiàn)是由于終點(diǎn)的設(shè)置錯(cuò)過(guò)了

19、檢測(cè)時(shí)間窗所致，提示我們微透析早期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)谷氨酸釋放或許更為合理。由此可見(jiàn)從神經(jīng)元微環(huán)境代謝的角度或許不能靈敏的反應(yīng)神經(jīng)元內(nèi)部的變化。接下來(lái)我們用熒光探針的技術(shù)探討間斷多次低溫對(duì)細(xì)胞內(nèi)部靶點(diǎn)的影響。
　　 在此之前，我們首先要明確間斷多次低溫是否對(duì)糖氧剝奪神經(jīng)元具有保護(hù)作用。我們用Hoechst33342對(duì)OGD后神經(jīng)元進(jìn)行定性染色，發(fā)現(xiàn)正常神經(jīng)元核染成淡藍(lán)色，而另外有部分細(xì)胞核被染成了范圍小，藍(lán)色熒光強(qiáng)度高的亮點(diǎn)，提示確實(shí)發(fā)生

20、了凋亡。于是我們用TUNEL法定量檢測(cè)各組間神經(jīng)元凋亡，結(jié)果顯示正常組為(6676.2±91.84)，OGD組(8327.6±177.19)，CH1組(7524.8±310.71),CH2組(6092.4±85.09),IH1組(4121±124.83),IH2組(7570±118.53)，IH3組(5628.20±699.82)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析提示，與正常對(duì)照組相比，糖氧剝奪后48小時(shí)，神經(jīng)元凋亡明顯增加。在持續(xù)低溫組中，6小時(shí)持續(xù)低溫可

21、以抑制糖氧剝奪后凋亡發(fā)生，但效果不及12小時(shí)持續(xù)低溫。所有間斷低溫組均可以有效抑制神經(jīng)元凋亡。其中，1小時(shí)間斷低溫的保護(hù)效果優(yōu)于1.5小時(shí)間斷低溫，但與2小時(shí)間斷低溫?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。間斷低溫與持續(xù)低溫組相比:1小時(shí)間斷低溫效果優(yōu)于6小時(shí)和12小時(shí)持續(xù)低溫，1.5小時(shí)間斷低溫的保護(hù)效果與6小時(shí)持續(xù)低溫相當(dāng)，但不如12小時(shí)持續(xù)低溫。2小時(shí)間斷低溫效果優(yōu)于6小時(shí)持續(xù)低溫，與12小時(shí)持續(xù)低溫的保護(hù)效果相當(dāng)。綜合以上結(jié)果分析提示1小時(shí)間斷低溫對(duì)糖氧

22、剝奪后神經(jīng)元凋亡保護(hù)效果最佳。由此可見(jiàn)，間斷多次低溫確實(shí)可以減少糖氧剝奪后神經(jīng)元凋亡。前期我們通過(guò)回顧性分析發(fā)現(xiàn)，氧化損傷，酸中毒，鈣超載，線粒體衰竭是神經(jīng)元受損的主要通路。接下來(lái)我們將通過(guò)熒光探針對(duì)其相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 活性氧的產(chǎn)生是氧化損傷的主要原因之一，我們用DCFH-DA熒光探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)發(fā)現(xiàn)，正常組（397.67±49.34），OGD組（1954±69.94），CH1組（424.67±21

23、.36），CH2組（395.33±33.47），IH1組（562.67±92.79），IH2組（331±26.06），IH3組（8098.33±1033.02）。統(tǒng)計(jì)分析提示，糖氧剝奪后48小時(shí)，神經(jīng)元內(nèi)活性氧顯著增加。在持續(xù)低溫組中，6小時(shí)持續(xù)低溫和12小時(shí)持續(xù)低溫均能抑制糖氧剝奪后神經(jīng)元內(nèi)活性氧產(chǎn)生，兩者的效果無(wú)差別。在間斷低溫組中，1小時(shí)，1.5小時(shí)間斷低溫均能抑制糖氧剝奪后活性氧產(chǎn)生，且二者的保護(hù)效果沒(méi)有差別。2小時(shí)間斷低溫?cái)?shù)據(jù)

24、變異較大，謹(jǐn)慎起見(jiàn)，暫不納入分析。間斷低溫與持續(xù)低溫抑制糖氧剝奪后活性氧的效果相當(dāng)。
　　 超氧陰離子自由基的產(chǎn)生也是氧化損傷的重要因素，我們用Dihydroethidium(DHE)熒光探針測(cè)量神經(jīng)元內(nèi)超氧陰離子自由基發(fā)現(xiàn)，正常組（69.4±3.36），OGD組（167.75±15.59），CH1組（64.2±2.28），CH2（114.4±7.54），IH1（43.6±2.30），IH2（52.8±1.79），IH3（52.

25、6±1.14）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析提示，糖氧剝奪后神經(jīng)元內(nèi)超氧陰離子自由基含量增加。在持續(xù)低溫組中，6小時(shí)和12小時(shí)持續(xù)低溫均可以抑制超氧陰離子自由基產(chǎn)生。在間斷低溫組中，1小時(shí)，1.5小時(shí)和2小時(shí)間斷低溫也同樣可以制糖氧剝奪后神經(jīng)元內(nèi)超氧陰離子自由基產(chǎn)生，其中1小時(shí)間斷低溫效果最好，1.5小時(shí)和2小時(shí)間斷低溫的保護(hù)效果沒(méi)有差別。間斷低溫與持續(xù)低溫相比，間斷低溫組減少OGD后超氧陰離子自由基的效果均優(yōu)于持續(xù)低溫組，其中1小時(shí)間斷低溫效果最佳。<

26、br>　　 我們用BCECF AM熒光探針，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)pH變化。其中正常組(994.2±58.87)，OGD組（67.8±24.45），CH1組(92.2±10.26)，CH2組(104.2±8.14)，IH1組（70.8±43.3），IH2組（90.0±51.87），IH3組（84.4±12.86）。統(tǒng)計(jì)分析提示，糖氧剝奪后神經(jīng)元內(nèi)pH水平明顯下降。持續(xù)低溫與間斷低溫雖有恢復(fù)OGD后神經(jīng)元pH的趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改善。

27、　　 我們用FLUO-3 AM熒光探針測(cè)量細(xì)胞內(nèi)游離鈣，由于同一批次胎鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)數(shù)量有限，為保證樣本的同質(zhì)性，我們首先測(cè)量糖氧剝奪組和低溫各組的平均熒光強(qiáng)度。由于不同批次的神經(jīng)元熒光變異非常大，不具有可比性。所以接下來(lái)利用另外一批次的神經(jīng)元補(bǔ)充測(cè)量正常組和糖氧剝奪組。具體數(shù)據(jù)如下，OGD組(1706.8±40.3)，CH1組(2586.8±97.91)，CH2組(741.4±13.46)，IH1組(797.4±12.82)，IH

28、2組(403.8±15.61)，IH3組(688.2±13.22)。補(bǔ)充測(cè)量正常組(58±1.58)，OGD組(84.2±1.64)。統(tǒng)計(jì)分析提示，糖氧剝奪后神經(jīng)元游離鈣含量升高。在持續(xù)低溫組中:6小時(shí)持續(xù)低溫不能降低神經(jīng)元糖氧剝奪后細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平，12小時(shí)持續(xù)低溫有效。在間斷低溫組中:1小時(shí)，1.5小時(shí)和2小時(shí)間斷低溫均可以降低神經(jīng)元糖氧剝奪后細(xì)胞內(nèi)游離鈣水平，其中1.5小時(shí)效果最佳，2小時(shí)間斷低溫的保護(hù)效果優(yōu)于1小時(shí)間斷低溫。間斷

29、低溫與持續(xù)低溫組相比，1小時(shí)間斷低溫抑制OGD后細(xì)胞內(nèi)鈣超載的效果不如12小時(shí)持續(xù)低溫，1.5小時(shí)間斷低溫和2小時(shí)間斷低溫的效果優(yōu)于12小時(shí)持續(xù)低溫，其中1.5小時(shí)間斷低溫抑制糖氧剝奪后神經(jīng)元內(nèi)鈣超載的效果最佳。
　　 我們用JC-1熒光探針測(cè)量線粒體膜電位變化發(fā)現(xiàn)，JC-1正常組(0.21±0.03)，OGD組(1.85±0.16)，CH1組(2.23±0.23)，CH2組(0.98±0.05)，IH1組(1.15±0.14)

30、，IH2組(0.61±0.14)，IH3組(0.93±0.05)。統(tǒng)計(jì)分析提示，糖氧剝奪能損害線粒體膜電位去極化。在持續(xù)低溫組中，6小時(shí)持續(xù)低溫不足矣抑制線粒體膜電位改變，12小時(shí)持續(xù)低溫有效。在間斷低溫組中，1小時(shí)，1.5小時(shí)和2小時(shí)間斷低溫均可以保護(hù)糖氧剝奪后線粒體膜電位。且它們之間的保護(hù)作用相同。間斷低溫與持續(xù)低溫組相比，1小時(shí)，1.5小時(shí)和2小時(shí)間斷低溫對(duì)糖氧剝奪后神經(jīng)元線粒體膜電位改變的保護(hù)效果同12小時(shí)持續(xù)低溫效果相當(dāng)。