重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、圍手術(shù)期腦缺血再灌注損傷并不少見(jiàn)且后果極其嚴(yán)重，腦中風(fēng)一旦發(fā)生，死亡率高達(dá)33％～60％。與心肺等器官相比，針對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療方法有限且效果不確實(shí)。因此，尋找防治腦損傷的有效措施并在臨床上推廣應(yīng)用是圍手術(shù)期腦保護(hù)研究亟待解決的重大難題。
　　自Wada1996年發(fā)現(xiàn)高壓氧預(yù)處理可誘導(dǎo)沙土鼠前腦缺血耐受產(chǎn)生之后,學(xué)者們對(duì)這一預(yù)處理方法進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)在心臟、肝臟和脊髓，高壓氧同樣可以誘導(dǎo)缺血耐受，減輕缺血再灌注損傷。但其

2、具體機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。我們以往的研究已經(jīng)證實(shí)重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用。其機(jī)制包括激活內(nèi)源性抗氧化通路，上調(diào)抗氧化物酶(CAT，SOD)活性，以及增加hemeoxygenase-1(HO-1)轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。但是以上實(shí)驗(yàn)僅在動(dòng)物水平研究高壓氧預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，高壓氧預(yù)處理對(duì)腦神經(jīng)元是否具有直接的保護(hù)作用尚不得而知。為了回答上述問(wèn)題，并進(jìn)一步闡明高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以原代培養(yǎng)的新生鼠皮

3、層神經(jīng)元為對(duì)象，采用氧糖剝奪模擬缺血再灌注損傷，研究重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　第一部分重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷保護(hù)作用的研究
　　目的：研究重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)新生鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的影響。方法：建立體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪（OGD）損傷模型。分為空白組（Sham）、對(duì)照組（OGD）和高壓氧（HBO）組（0.35MPa，2h，5d）。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、SOD、C

4、AT含量測(cè)定、甲基噻唑基四唑比色微量分析（MTT）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)和乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)定等方法觀察OGD所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷以及重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)這種損傷的影響。結(jié)果：（1）體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至8d左右，神經(jīng)元的突起互相交織成網(wǎng)狀，形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，表明神經(jīng)元已成熟。（2）HBO組高壓氧預(yù)處理5d后24hOGD前神經(jīng)元活力與與SHAM組光密度值無(wú)明顯差異。OGD后24h細(xì)胞活力下降，OGD組與HBO組和Sham組相比光密度值明顯降低(

5、P<0.05)。（3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在OGD后24h，HBO組和Sham組僅有部分神經(jīng)元發(fā)生凋亡，而OGD組神經(jīng)元凋亡率明顯增多，Sham組、HBO組與OGD組神經(jīng)元凋亡率分別為2.21％、2.69％、4.71％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（4）OGD后24hOGD組與Sham組和HBO組相比，LDH釋放量明顯增多(P<0.05)。（5）在高壓氧預(yù)處理1-5d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SOD值三組均無(wú)顯著差異；OGD后24h與Sha

6、m組和HBO組相比，OGD組SOD值明顯降低（P<0.05）。隨著高壓氧預(yù)處理的重復(fù)，HBO組CAT含量逐漸升高，Sham組和OGD組CAT含量變化不大。OGD后24h三組CAT均明顯降低，但HBO組仍高于其它兩組（P<0.05）。結(jié)論：氧糖剝奪可導(dǎo)致神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，而重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)這種損傷具有保護(hù)作用。
　　第二部分PPARγ信號(hào)參與重復(fù)高壓氧處理對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪損傷保護(hù)作用中的機(jī)制研究
　　實(shí)驗(yàn)一PPARγ在

7、重復(fù)高壓氧處理對(duì)皮層神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪保護(hù)作用中的變化研究
　　目的：研究PPARγ信號(hào)在重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)新生鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷保護(hù)作用中的變化研究。方法:建立體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型，分為空白組（Sham）、對(duì)照組（OGD）和高壓氧（HBO）組（0.35MPa，2h，5d）。分別在OGD后2、24、48hour行WesternBlot和RT-PCR方法測(cè)定PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)。結(jié)果：HBO組PPARγ

8、蛋白和mRNA的表達(dá)較OGD組和SHAM組明顯增高。通過(guò)對(duì)OGD后2、24、48h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)變化觀察顯示，缺血后2h開(kāi)始有表達(dá)，隨時(shí)間的推移，其表達(dá)逐漸增加，24h達(dá)高峰，48h后開(kāi)始下降。但仍高于OGD組和SHAM組（P<0.05）。結(jié)論：重復(fù)高壓氧預(yù)處理可以使皮層神經(jīng)元PPARγ表達(dá)增加，對(duì)氧糖剝奪誘導(dǎo)的損傷產(chǎn)生保護(hù)。這種保護(hù)作用的機(jī)制是通過(guò)PPARγ表達(dá)的上調(diào)實(shí)現(xiàn)的。
　　實(shí)驗(yàn)二PPARγ激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)重復(fù)高壓氧處理

9、誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元細(xì)胞氧糖剝奪保護(hù)作用的影響
　　目的：研究PPARγ在重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)抗新生鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷中的作用以及PPARγ激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)這種保護(hù)的影響。方法：建立體外培養(yǎng)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷模型，分為空白組（Sham）、氧糖剝奪組（OGD）、高壓氧組（HBO）（0.35MPa，2h）、激動(dòng)劑組（ACT）和拮抗劑組（IHB）。ACT組末次預(yù)處理24小時(shí)后，羅格列酮10μM濃度加入培養(yǎng)基，1h后行2小時(shí)OGD，其

10、后更換為正常培養(yǎng)基。IHB組末次預(yù)處理24小時(shí)后，GW966210μM濃度加入培養(yǎng)基，30min后行2小時(shí)OGD，其后更換為正常培養(yǎng)基。通過(guò)甲基噻唑基四唑比色微量分析（MTT）、細(xì)胞凋亡和LDH檢測(cè)以及RT-PCR和Westernblotting等方法，觀察重復(fù)高壓氧預(yù)處理后，OGD所導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)的變化，以及PPARγ激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)這種保護(hù)作用的影響。結(jié)果：（1）高壓氧預(yù)處理5天過(guò)程中各

11、組光密度值無(wú)明顯差異。OGD后24h各組細(xì)胞活力下降，OGD組和IHB組與HBO組、Sham組和ACT組相比光密度值明顯降低（P<0.05）。HBO組和ACT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）OGD后24h，OGD組、IHB組、HBO組和Sham組與ACT組相比，LDH釋放量明顯增多(P<0.05)。HBO組和ACT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）OGD后24h，在HBO組、Sham組和ACT組僅有部分神經(jīng)元發(fā)生凋亡，而在OGD組和IHB組神

12、經(jīng)元凋亡率明顯增多，Sham組、OGD組、HBO組、ACT組和IHB組神經(jīng)元凋亡率分別為2.82％、4.71％、3.01％、2.69％、3.47％。OGD組和IHB組與HBO組、Sham組和ACT組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。HBO組和ACT組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（4）PPARγ蛋白和mRNA表達(dá)：在缺血后2、24h，ACT組明顯高于其它各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。缺血后24h，IHB組明顯低于于其它各組，差異有

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：PPARγ激動(dòng)劑可以促進(jìn)PPARγmRNA和蛋白表達(dá)的增加，對(duì)皮層神經(jīng)元氧糖剝奪損傷有保護(hù)作用；而PPARγ拮抗劑則會(huì)逆轉(zhuǎn)這種保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　　1、重復(fù)高壓氧預(yù)處理對(duì)由氧糖剝奪導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用。
　　2、高壓氧預(yù)處理誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元缺血耐受產(chǎn)生的機(jī)制部分是通過(guò)上調(diào)PPARγ的表達(dá)，增強(qiáng)了機(jī)體在缺血再灌注過(guò)程中清除氧自由基的能力實(shí)現(xiàn)的。
　　3、PPARγ激動(dòng)劑可