高壓氧預(yù)處理對(duì)大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、青光眼是全球最常見的不可逆性致盲眼病之一，青光眼視神經(jīng)病變是該病致盲的根本原因。目前公認(rèn)的發(fā)生機(jī)制是由于眼壓升高造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生以變性壞死為特征的原發(fā)性損害，隨后又通過一系列途徑誘發(fā)以視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞持續(xù)性凋亡為特征的繼發(fā)性損害，從而導(dǎo)致視神經(jīng)功能進(jìn)行性損傷。目前除了應(yīng)用藥物、手術(shù)等手段降低升高的眼內(nèi)壓，控制疾病的原發(fā)性損害以外，尚無有效手段防治視神經(jīng)的繼發(fā)性損害。視神經(jīng)由RGCs的軸索組成，是間腦白質(zhì)的主要成分

2、，視神經(jīng)和視網(wǎng)膜作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)在顱外的延伸，在位置上具有著中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他部分不可比似的易操作性，因而視神經(jīng)損傷模型常被用來模擬大腦的軸突損傷；其中視神經(jīng)鉗夾傷模型能夠較好地模擬RGCs繼發(fā)性凋亡，即使視神經(jīng)被完全截?cái)嗪?，仍有相?dāng)一部分?jǐn)?shù)量的RGCs能夠存活一段時(shí)間。這種鉗夾傷后的神經(jīng)退行性過程與青光眼視神經(jīng)病變的病理過程相類似。
　　 高壓氧治療已在臨床應(yīng)用多年，具有確切治療效果的疾病包括一氧化碳中毒、中風(fēng)、空氣栓塞及減壓病

3、等。目前大量的研究顯示高壓氧預(yù)處理對(duì)大腦缺血缺氧引起的遲發(fā)型損傷有確切的神經(jīng)保護(hù)作用，但HBO-PC保護(hù)效應(yīng)的確切機(jī)制尚未闡明，在臨床應(yīng)用前還需要大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。目前，人們普遍認(rèn)為HBO誘導(dǎo)腦神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制主要有以下兩個(gè)方面：一是HBO預(yù)處理誘導(dǎo)機(jī)體組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧，進(jìn)而引起機(jī)體的抗氧化酶增多，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷能力；二是HBO預(yù)處理可誘導(dǎo)腦內(nèi)的抗凋亡蛋白升高，增強(qiáng)機(jī)體的抗凋亡損傷能力。
　　 視神經(jīng)鉗夾傷后的視網(wǎng)膜

4、神經(jīng)元退行性變過程和腦損傷所引起的繼發(fā)性神經(jīng)元退變過程相似，因此我們采用一種臨床實(shí)際工作中可行而有效的高壓氧預(yù)處理方法，從病理學(xué)、形態(tài)學(xué)、視功能等各個(gè)方面驗(yàn)證這種預(yù)處理方法對(duì)視神經(jīng)不完全損傷是否具有保護(hù)效應(yīng)，并初步探討HBO預(yù)處理發(fā)揮視神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　 第一部分大鼠不完全視神經(jīng)損傷模型的建立及高壓氧預(yù)處理對(duì)視神經(jīng)不完全損傷的保護(hù)效應(yīng)
　　 目的：建立穩(wěn)定的大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型，研究高壓氧預(yù)處理對(duì)大鼠視神經(jīng)不

5、完全損傷的保護(hù)效應(yīng)。
　　 方法：采用2.5 ATA，100％O2，每天2次，連續(xù)2天的高壓氧預(yù)處理方法，末次處理后次日采用Yasargil動(dòng)脈瘤夾制作大鼠視神經(jīng)鉗夾傷模型。動(dòng)物分為Sham組、ONC組，HBO+ONC組。分別在建模后1周或2周采用HE染色、熒光金逆行標(biāo)記、閃光視覺誘發(fā)電位及TUNEL觀察或檢測(cè)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量和視神經(jīng)功能的改變。
　　 結(jié)果：建模1周時(shí)Sham組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層中HE著色的細(xì)胞

6、數(shù)量為89.5±9.4個(gè)/高倍視野，2周時(shí)為92.7±9.1個(gè)/高倍視野；而1周和2周時(shí)HBO+ONC組的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層中HE著色的細(xì)胞數(shù)量顯著較ONC組多(69.3±7.4 vs56.6±6.5個(gè)/高倍視野，1 w，P＜0.01；62.3±6.1 vs46.1±6.6，2 w，P＜0.01)。建模2周時(shí)熒光金逆行標(biāo)記顯示，Sham組的存活視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的平均密度為1650±216/mm2，而HBO+ONC組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞平均密度顯著

7、高于Sham組(995±158/mm2和478±101/mm2，P＜0.01)。閃光視覺誘發(fā)電位結(jié)果顯示，相對(duì)于HBO+ONC組，ONC組P1波的潛伏期延長、振幅降低。視神經(jīng)鉗夾傷后1周時(shí)Sham組、HBO+ONC組和ONC組P1波的潛伏期和振幅分別為90±4ms、944ms、108±6ms(P＜0.05，HBO+ONC vs ONC)；17±2μv、18±3μv和12±2μv(P＜0.01，HBO+ONC vs ONC)。2周時(shí)Sha

8、m組、HBO+ONC組和ONC組P1波的潛伏期和振幅分別為92±7ms、117±12ms、169±15ms(P＜0.01，HBO+ONC vs ONC)；21±3μv、14±2μv和7±1μv(P＜0.01，HBO+ONCvs ONC)。
　　 結(jié)論：HBO預(yù)處理能使視神經(jīng)損傷后的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞存活率顯著提高，同時(shí)改善視神經(jīng)的功能狀態(tài)，確認(rèn)HBO預(yù)處理對(duì)大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護(hù)效應(yīng)。
　　 第二部分高壓氧預(yù)處理抑制線粒體

9、途徑的凋亡誘導(dǎo)對(duì)大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護(hù)效應(yīng)
　　 目的：研究高壓氧預(yù)處理對(duì)線粒體凋亡途徑的影響。
　　 方法：按第一部分方法進(jìn)行高壓氧預(yù)處理和建模。使用TUNEL法檢測(cè)RGCs凋亡數(shù)量；ELISA法檢測(cè)視網(wǎng)膜caspase-3和caspase-9的酶活性；Western Blot檢測(cè)cytochrome c、Bcl-2、BclxL、和Bax蛋白表達(dá)量。
　　 結(jié)果：HBO預(yù)處理能明顯減少視神經(jīng)不完全損傷后RG

10、Cs的凋亡陽性細(xì)胞數(shù)(ONC:19.1±4.2/HPF vs.HBO+ONC:7.2±1.3/HPF，P＜O.01)，ONC組視網(wǎng)膜組織的caspase-3和caspase-9酶相對(duì)活性顯著高于HBO+ONC組(P＞0.05)。HBO預(yù)處理顯著減少了視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜組織胞漿cytochrome c的蛋白水平(P＜0.05)，同時(shí)提高了抗凋亡蛋白Bcl-2、BclxL的水平(P＜0.01，P＜0.05)，但對(duì)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)影響不

11、明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：高壓氧預(yù)處理可能通過抑制線粒體途徑的凋亡發(fā)揮對(duì)視神經(jīng)不完全損傷的保護(hù)效應(yīng)。
　　 第三部分高壓氧預(yù)處理調(diào)控HIF/EPO通路誘導(dǎo)對(duì)大鼠視神經(jīng)不完全損傷的保護(hù)效應(yīng)
　　 目的：研究HBO預(yù)處理的保護(hù)效應(yīng)是否與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1及下游神經(jīng)保護(hù)性基因EPO的表達(dá)有關(guān)。
　　 方法：按第一部分方法進(jìn)行高壓氧預(yù)處理，末次處理后次日直接取材。動(dòng)物分為對(duì)照組和HBO預(yù)

12、處理組。使用RT-PCR方法和Western Blot檢測(cè)HBO預(yù)處理對(duì)視網(wǎng)膜組織HIF-1及其下游基因EPO的mRNA表達(dá)和蛋白含量的影響，并檢測(cè)EPO下游信號(hào)分子P-Akt和HSP-27蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：HBO預(yù)處理能顯著上調(diào)大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1和EPO mRNA的表達(dá)，分別是對(duì)照組的13.38±1.97倍和5.55±1.03倍(P＜0.01)；同時(shí)HIF-1α和EPO蛋白表達(dá)顯著增加，分別是對(duì)照組的1.8