黃芩苷預(yù)處理對(duì)EAE大鼠軸索和神經(jīng)元的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是由CD4<'+>T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的以炎性脫髓鞘為特征的動(dòng)物模型。目前認(rèn)為，在EAE的發(fā)病過程中軸索損害和神經(jīng)元的凋亡也同樣起著重要的作用，且與進(jìn)行性的神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中調(diào)控神經(jīng)元的凋亡。糖皮質(zhì)激素對(duì)EAE有治療作用，但其副作用限制了臨床應(yīng)用。我們以前的研究認(rèn)為黃芩苷可通過抑制NF．vd3的活性減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生而對(duì)感染性腦水腫有保護(hù)作用，并可以抑制

2、缺血缺氧性腦損傷中神經(jīng)元的凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過觀察黃芩苷及地塞米松預(yù)處理對(duì)EAE大鼠神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NF-κB的激活與軸索損害和神經(jīng)元凋亡之間的關(guān)系，探討黃芩苷預(yù)處理對(duì)EAE是否具有保護(hù)作用及其機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)分以下兩個(gè)部分： 一、黃芩苷預(yù)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠軸索的保護(hù)作用 目的：觀察黃芩苷預(yù)處理對(duì)EAE大鼠軸索損傷及神經(jīng)功能障礙的影響。 方法：健康6～8周齡的Wistar大鼠96只，隨機(jī)分為4組：①空白

3、對(duì)照組(CON，n=24)；②實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎組(EAE，n=24)；③地塞米松預(yù)處理組(DXM，n=24)；④黃芩苷預(yù)處理組(BAC,n=24)。DXM組在免疫當(dāng)日開始予以地塞米松0.5mg、200g×7天，腹腔注射；BAC組在免疫當(dāng)日開始予以2﹪黃芩苷溶液200mg/kg×7天，腹腔注射；EAE組和CON組每日以同體積的生理鹽水腹腔注射。觀察各組動(dòng)物臨床發(fā)病率、體重變化、神經(jīng)功能評(píng)分等。分別與免疫后第7天、第14天、第21天

4、處死大鼠，留取脊髓(腰膨大處)、腦干，部分置于液氮內(nèi)保存，部分行石蠟包埋、病理切片，比較各組HE染色的病灶數(shù)、髓鞘染色，免疫組化檢測(cè)NF-200KDa密度變化。 結(jié)果：①行為學(xué)改變：CON組大鼠無發(fā)病，DXM組和BAC組發(fā)病率分別為56.25﹪(9/16)，50﹪(8/16)較EAE組87.50﹪(14/16)明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.01)。CON組大鼠體重呈明顯上升趨勢(shì)。EAE組大鼠于發(fā)病前1～2天體重開始下降，發(fā)

5、病高峰期體重下降最明顯，疾病緩解后體重開始上升。在第7天、14天、21天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上體重與CON組相比差異有顯著性意義(P<0.01)。DXM組大鼠體重下降，與EAE組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。黃芩苷組各時(shí)間點(diǎn)體重緩慢上升，與EAE相比差異有顯著性意義(P<0.01)。E_AE組首發(fā)癥狀時(shí)間為8.75±0.25天，DXM組和BAC組首發(fā)癥狀時(shí)間分別為12.8±0.29天和13.06±0.23天，較EAE組發(fā)病延遲，差異有顯著

6、性意義(P<0.01)。DXM組、BAC組最高神經(jīng)功能評(píng)分分別為1.56±0.34，1.46±0.20與EAE組(2.78±0.31)相比差異有顯著性意義(P<0.01)。②病理改變：EAE組炎性病灶數(shù)為8.21±3.92，DXM組、BAC組脊髓內(nèi)炎性病灶數(shù)分別為3.00±1.83和4.65+1.24，與EAE組比較明顯減少，差異有顯著性意義(P<0.05)。EAE組各時(shí)間點(diǎn)軸索密度較CON組明顯減低，DXM組、BAC組軸索密度較EAE

7、組有所增加，差異有顯著性意義(P<0.01)。 結(jié)論：黃芩苷預(yù)處理能明顯減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)軸索，改善EAE大鼠癥狀，降低神經(jīng)功能評(píng)分。 二、黃芩苷預(yù)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經(jīng)元凋亡的影響及機(jī)制 研究目的：觀察黃芩苷預(yù)處理對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠神經(jīng)元凋亡及NF-κBp65蛋白及mRNA表達(dá)的影響。探討神經(jīng)元凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法：Wistar大鼠隨機(jī)分組和處理方法同第一部分。取脊髓組

8、織50mg提取總RNA，行RT-PCR，檢測(cè)NF-κBp65 mRNA的表達(dá)。石蠟切片行免疫組化染色，TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)元的凋亡。結(jié)果：①神經(jīng)元凋亡指數(shù)(AI)：CON組偶見細(xì)胞凋亡，EAE組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)A1分別為23.25±1.82，63.00±4.66和31.50±3.63，較CON組明顯增高，差異有顯著性意義(P<0.01)；DXM組AI值分別為16.75±1.28，33.88±1.46和22.00±2.45，BAC組AI值分別為

9、15.25±1.67，34.25±3.28和21.88+3.09，兩組AI值與EAE組相比明顯降低，差異有顯著性意義(P<0.01)。②神經(jīng)元NF-κBp65蛋白表達(dá)檢測(cè)：CON組脊髓偶見NF-κBp65核移位的陽性神經(jīng)元。EAE組免疫七天后脊髓內(nèi)神經(jīng)元NF-κBp65陽性率開始增加為19.13±2.53，第14天增加更明顯為50.50±8.07，21天陽性率減少為33.50±6.16，各時(shí)間點(diǎn)與CON組相比明顯增加，差異有顯著性意義(

10、P<0.01)。三個(gè)時(shí)間點(diǎn)陽性率DXM組為13.12±1.72，28.55±2.49和18.00±3.30，BAC組為14.00±1.51，32.75±3.45和17.37±2.44，兩組與EAE相比明顯減少，差異有顯著性意義(P<0.05)。③大鼠脊髓NF-κBp65mRNA檢測(cè)。 結(jié)果：CON組NF-κBp65 cDNA灰度比為0.55±0.065、0.53±0.083、0.54±0.082，各時(shí)間點(diǎn)變化不明顯。EAE組各時(shí)

11、問點(diǎn)灰度比分別為0.78±0.062、0.98±0.105、0.83±0.071與CON組比較明顯增高，差異有顯著性意義(P<0.01)。DXM、BAC組各時(shí)間點(diǎn)灰度比分別為(0.67+0.040，0.84+0.051和0.68±0.065)，(0.65+0.038，0.82+0.103和0.70±0.069)，兩組與EAE組比較明顯下降，差異有顯著性意義(P<0.01)。 結(jié)論：黃芩苷預(yù)處理能明顯抑制NF-κBp65的活化，減