BDNF對(duì)高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞模型，探討外源性腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)對(duì)高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的保護(hù)效應(yīng)，及可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞機(jī)制。同時(shí)建立糖尿病大鼠動(dòng)物模型，探討其視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化，以及與視網(wǎng)膜BDNF、酪氨酸激酶受體B(Trk(B)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)變化的關(guān)系，為BDNF潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值提供理論依據(jù)。
　　 方法：本研究分兩大部分進(jìn)行。第一部分：1、

2、以0、5.5、15、25、35mmol/L不同濃度葡萄糖分別作用于原代培養(yǎng)的Wistar大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元24、48、72h，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法及流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)神經(jīng)元的存活率、凋亡率，確定葡萄糖最適干預(yù)濃度及時(shí)間，建立原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元的高糖模型。2、予以75、100、125ng/mL不同濃度BDNF干預(yù)高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元96h后，采用MTT法及流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)神經(jīng)元的存活率、凋亡率的變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染

3、色法觀察BDNF受體TrkB的蛋白表達(dá)變化，確定BDNF最適干預(yù)濃度及時(shí)間。3、采用Western Blot法及逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)4個(gè)不同組(正常對(duì)照組，正常對(duì)照+BDNF組，高糖模型組，高糖+BDNF組)的TrkB、ERK的蛋白及mRNA，PTrkB、PERK蛋白的表達(dá)水平，分析BDNF對(duì)高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元中TrkB、ERK磷酸化的影響。第二部分：1、建立糖尿病大鼠動(dòng)物模型，以正常大鼠為對(duì)照，分別于糖尿病成

4、模后4、12、24W，采用蘇木素/伊紅(HE)染色觀察大鼠后極部視網(wǎng)膜總厚度、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)計(jì)數(shù)以及視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)變化，透射電鏡觀察糖尿病24W大鼠視網(wǎng)膜各層組織細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。2、于糖尿病4、12、24W，采用免疫組織熒光化學(xué)法、免疫組織化學(xué)法、Western blot方法分別檢測(cè)糖尿病組與正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜GFAP、TrkB及ERK、BDNF蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR法檢測(cè)兩組大鼠視網(wǎng)膜TrkB、ERK、BD

5、NFmRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：第一部分：1、隨葡萄糖濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜神經(jīng)元的存活率下降、凋亡率增多，以35mmol/L葡萄糖干預(yù)72h的神經(jīng)元存活率(OD值：0.0268±0.0116)下降、凋亡率(40.123±7.576％)增加最為顯著(p<0.01)。2、隨著B(niǎo)DNF濃度的增加，高糖狀態(tài)下視網(wǎng)膜神經(jīng)元存活率增加、凋亡率下降，伴隨著B(niǎo)DNF受體TrkB蛋白表達(dá)增高，以100ng/mlBDNF干預(yù)96h組凋亡

6、率(3.458±1.531％)下降及TrkB蛋白表達(dá)增高最為顯著(p<0.05)。3、TrkB蛋白及mRNA在其它各組的表達(dá)均較正常對(duì)照組增加(p<0.05)，高糖+BDNF組比較高糖組TrkB表達(dá)亦增加(p<0.05)；ERK蛋白及mRNA表達(dá)水平在各組之間無(wú)差異(p>0.05)；PERK、PTrkB蛋白在高糖組的表達(dá)與正常對(duì)照組比較無(wú)差異(p>0.05)，正常對(duì)照+BDNF組與高糖+BDNF組比較其它2組PERK、PTrkB表達(dá)顯著

7、增加(p<0.05)，高糖+BDNF組比較其它各組PERK、PTrkB表達(dá)顯著增加(p<0.05)。第二部分：1、糖尿病組在12、24W兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與正常組相比較，后極部視網(wǎng)膜總厚度明顯變薄(60.26±4.33、52.11±5.23μm)，RGCs細(xì)胞數(shù)減少(67.57±2.59、54.93±2.02個(gè))，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。糖尿病24W透射電鏡觀察顯示：視網(wǎng)膜RGCs及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞有凋亡征象。2、免疫組織熒光化學(xué)法檢測(cè)顯

8、示：隨病程增加，GFAP蛋白在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的表達(dá)依次增強(qiáng)。免疫組織化學(xué)法及RT-PCR法檢測(cè)顯示：在病程4W時(shí)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的TrkB蛋白及mRNA表達(dá)比較正常組明顯增加(p<0.05)，12W時(shí)表達(dá)比較正常組明顯下降，24W時(shí)下降更明顯(p<0.01)；病程4、12、24W時(shí)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的ERK蛋白及mRNA的表達(dá)均較正常組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，但糖尿病各組之間比較無(wú)差異(p>0.05)。Western b

9、lot法及RT-PCR法檢測(cè)顯示：隨病程增加，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜BDNF蛋白及mRNA表達(dá)依次下降，比較正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，且糖尿病各組之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 結(jié)論：1、體外高糖水平可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡。2、外源性BDNF對(duì)高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的凋亡具有保護(hù)作用，并能有效上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)TrkB蛋白及mRNA、PERK蛋白、PTrkB蛋白的表達(dá)，從而可能通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活