應(yīng)用多電極陣列研究視網(wǎng)膜疾病動物模型視網(wǎng)膜神經(jīng)元環(huán)路.pdf

1、動物視覺的檢測主要分為主觀與客觀兩大類。前者主要通過行為學(xué)方法,如食物誘導(dǎo)訓(xùn)練動物辨別目標(biāo)和視動性頭部追隨運動或眼球震顫等。但是,這些方法有著共同的缺點:動物訓(xùn)練困難且訓(xùn)練時間的長短對結(jié)果的影響明顯。目前的客觀檢測方法主要是視覺電生理檢查技術(shù),包括視網(wǎng)膜電圖、視覺誘發(fā)電位、眼電圖等檢查項目。這些客觀檢查項目是通過光、電刺激誘導(dǎo)視網(wǎng)膜到視覺中樞的各個水平的電反應(yīng),記錄電生理活動特征來客觀地反應(yīng)視覺功能。然而,這項技術(shù)反應(yīng)的是綜合電位變化,

2、其對單個視覺細(xì)胞功能的檢測有一定的限制性。如藥物直接干預(yù)視網(wǎng)膜細(xì)胞的研究及對視網(wǎng)膜細(xì)胞群體間相互作用關(guān)系的研究,就很難從傳統(tǒng)的活體視覺電生理檢測中實現(xiàn)。膜片鉗技術(shù)雖然能夠記錄單個細(xì)胞的電生理功能變化,但在研究神經(jīng)元間的相互關(guān)系時應(yīng)用受限。對于一個神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)而言,單個細(xì)胞功能的實現(xiàn)必須是建立在完整的神經(jīng)元環(huán)路的基礎(chǔ)上,因此膜片鉗技術(shù)有其不足之處。
　　近年來,隨著微電極技術(shù)的發(fā)展,多電極陣列(Multi-electrodearray,

3、MEA)記錄系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域。MEA是一種同步記錄組織中多個神經(jīng)元細(xì)胞的電生理特征的方法。通過該技術(shù)不僅可以了解單個神經(jīng)元的反應(yīng),還可以分析多個神經(jīng)元之間的相互關(guān)系,為神經(jīng)元環(huán)路的研究提供技術(shù)保證。本實驗旨在應(yīng)用MEA技術(shù)從微電極上記錄的場電位和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的放電特征,來研究遺傳性視網(wǎng)膜疾病動物模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)元環(huán)路特點,為進一步明確幾種遺傳性視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病機理和探索其有效治療方案提供理論基礎(chǔ)。
　　材料與方法:

4、
　　采用成年SPF級雄性8~10周齡的SD大鼠、先天性靜止性夜盲(congenitalstationarynightblindness,CSNB)大鼠、昆明小鼠及快速視網(wǎng)膜變性(retinaldegenerationfast,rdf)小鼠。經(jīng)過1h的暗適應(yīng)后,在微弱的紅光中將實驗動物頸椎脫臼處死,取出眼球。用剪刀或刀片沿鋸齒緣將眼球切成兩半,去除角膜、晶狀體及玻璃體后,用鑷子小心地分離出神經(jīng)視網(wǎng)膜。通過中空的濾紙片將離體視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)

5、移到微電極板上,使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞面粘于電極。標(biāo)本由哺乳動物Ringer’s液進行灌流,并通以含95％O2和5%CO2的混合氣體,同時維持pH值為7.4左右,溫度34℃,灌流速度1ml/min。灌流液孵育15mins后,采用多電極陣列系統(tǒng)MED64(日本AlphaMedScientific公司)開始記錄不同光照刺激(不同光照亮度、刺激時間、刺激光波長等)或電刺激模式下實驗動物視網(wǎng)膜電生理特征,采樣率20kHz。記錄的數(shù)據(jù)經(jīng)放大器處理后存入計算

6、機,以備離線分析。采用Offlinesorter和NeuroExplorer等軟件對數(shù)據(jù)進行檢測與處理。
　　結(jié)果:
　　1.采用MEA技術(shù)可以記錄到離體視網(wǎng)膜的電生理特征,給予不同的光照亮度刺激時,可以觀察到視網(wǎng)膜場電位幅值隨光照亮度改變存在一定的變化趨勢。在野生型SD大鼠,當(dāng)光照亮度小于256cd/m2時,隨著光照亮度的增加,視網(wǎng)膜場電位的幅值增加;當(dāng)光照亮度大于256cd/m2時,視網(wǎng)膜場電位幅值不再隨光亮度的增加而增

7、加。
　　2.當(dāng)給予長時程的光照刺激時,采用MEA技術(shù)可以記錄到離體視網(wǎng)膜明顯的撤光相關(guān)場電位。野生型SD大鼠表現(xiàn)為一個撤光相關(guān)的負(fù)向波,且振幅較小;而CSNB大鼠則表現(xiàn)為一個振幅相對較大的正向波。
　　3.電刺激誘發(fā)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞放電的長潛伏期反應(yīng)中觀察到CSNB大鼠的放電頻率在各個電極距離處均明顯低于野生型SD大鼠(P<0.05)。
　　4.同樣亮度(256cd/m2)的不同顏色光刺激野生型昆明小鼠離體視網(wǎng)膜時,場電位

8、的幅值表現(xiàn)為藍(lán)光>綠光>白光>紅光(P<0.05)
　　5.rdf小鼠視網(wǎng)膜對各顏色光均無明顯的場電位反應(yīng),除了極少一部分視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表現(xiàn)為藍(lán)光比較敏感外,大部分的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在顏色光刺激下未能誘發(fā)出相關(guān)的放電反應(yīng)。在野生型昆明小鼠中也記錄到相類似的對藍(lán)光相對敏感的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1.盡管MEA記錄技術(shù)在評估視網(wǎng)膜功能時也存在一些不足,但是作為一種新方法,它融合并發(fā)展了傳統(tǒng)ERG場電位記錄及部分膜片鉗的

9、功能,在保證神經(jīng)元環(huán)路完整的情況下,從多個方面對視網(wǎng)膜功能做出綜合評定。
　　2.CSNB大鼠的撤光反應(yīng)存在異常。由于目前大部分實驗表明ERG中的撤光反應(yīng)(d波)主要起源于OFF型雙極細(xì)胞,因此推斷CSNB大鼠的OFF型通路存在異常。
　　3.CSNB大鼠RGCs電刺激后的長潛伏期反應(yīng)均明顯低于野生型大鼠,結(jié)合我們實驗室前期關(guān)于CSNB大鼠化學(xué)突觸功能障礙的結(jié)果,可以從側(cè)面證明電刺激后誘發(fā)的長潛伏期反應(yīng)可能與外層視網(wǎng)膜神經(jīng)元