乙酰葛根素對氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡的影響.pdf

1、研究背景及研究目的
　　中風(fēng)為全球性常見病和多發(fā)病，具有發(fā)病率高，致殘率高，死亡率高，嚴重危害人們的健康，給國家，社會，家庭及個人帶來了沉重的精神和生活負擔(dān)。到目前為止，中風(fēng)的發(fā)病原因及發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機制尚未明確，缺乏對多數(shù)患者安全有效的治療措施和藥物。tPA，是唯一被美國FDA批準(zhǔn)的用于治療中風(fēng)的藥物。但其治療時間窗僅局限于發(fā)病后的4.5h內(nèi)。超過此時間段應(yīng)用，則會導(dǎo)致嚴重的出血及腦水腫等不良反應(yīng)?，F(xiàn)實中，由于諸多因素的影

2、響，絕大多數(shù)的病人在發(fā)病后的4.5h不能到達醫(yī)療機構(gòu)，因此，也就失去了使用tpA進行溶栓治療的機會，并且，tpA可能具有神經(jīng)毒性和或?qū)е律窠?jīng)元的凋亡反應(yīng)等不良反應(yīng)。因此，中風(fēng)的治療成為全球醫(yī)務(wù)工作者研究的重點之一。在目前已有的中風(fēng)發(fā)病機制中，中風(fēng)病人腦區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元發(fā)生的凋亡反應(yīng)引起了越來越多學(xué)者的重視，并被認為是治療中風(fēng)的重要的靶向目標(biāo)之一。
　　葛根素是從中藥葛根中提取的異黃酮類化合物，臨床上用于治療心、腦血管等疾病的已有20余

3、年。但是，葛根素不良反應(yīng)較多，且脂溶性低，不能有效的通過血腦屏障，限制了其在臨床的廣泛使用。乙酰葛根素是在葛根素的基礎(chǔ)上經(jīng)結(jié)構(gòu)改造引入側(cè)鏈得到的新型異黃酮類化合物，與葛根素相比，乙酰葛根素的脂溶性顯著提高，能夠通過血腦屏障。已有體外動物實驗表面，乙酰葛根素能顯著提高缺氧復(fù)氧神經(jīng)元的細胞活力，降低細胞凋亡率，提高胞內(nèi)bcl-2和Bax的表達，提示對缺氧缺糖神經(jīng)元具有保護作用，是一個具有開發(fā)前景的藥物。
　　本實驗在課題組前期工作的基

4、礎(chǔ)上進一步研究乙酰葛根素對腦缺血再灌注損傷的作用。我們選用大鼠胎鼠的海馬神經(jīng)元作為研究對象，采用體外培養(yǎng)的神經(jīng)元缺氧缺糖再灌注法模型，旨在觀察受缺氧缺糖損傷的海馬神經(jīng)元中神經(jīng)元活力，神經(jīng)元凋亡發(fā)生率和凋亡相關(guān)因子的變化以及乙酰葛根素對上述所述項目的影響。本實驗通過動態(tài)檢測缺氧缺糖再灌注神經(jīng)元活力，凋亡發(fā)生率以及乙酰葛根素的作用，篩選出觀測最佳時間點，并以此時間點作為后續(xù)實驗指標(biāo)標(biāo)本收集點，測定凋亡相關(guān)印跡的變化以及乙酰葛根素的作用，觀察

5、該藥物對大鼠胎鼠海馬神經(jīng)元的抗凋亡作用并對涉及到的機制做深入研究，為研究開發(fā)乙酰葛根素用于治療缺血性腦血管疾病提供實驗依據(jù)。
　　本實驗分為二個部分:
　　第一部分:乙酰葛根素對氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的細胞活力及形態(tài)學(xué)影響
　　第二部分:乙酰葛根素對氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)因子的影響
　　第一部分:乙酰葛根素對氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的細胞活力及形態(tài)學(xué)影響
　　目的
　　采用體外分離培養(yǎng)海

6、馬神經(jīng)元，缺氧缺糖后復(fù)氧復(fù)糖建立缺血再灌注模型，利用形態(tài)學(xué)上和細胞活力的變化，觀察乙酰葛根素對糖氧剝離誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷的影響，并篩選出后續(xù)實驗的最佳時間點。
　　方法
　　取孕17.5-18.5天的wistar大鼠的胎鼠，剝離海馬神經(jīng)元進行原代培養(yǎng)。每天于倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長狀況，每三天半量換液一次，至生長8d后取活力好的神經(jīng)元進行后續(xù)實驗。
　　實驗分組及OGD/R
　　根據(jù)藥物濃度的不同實驗共分5組:

7、
　　1.正常對照組Neurobasalmedium(NB)+B27培養(yǎng)至8天后，換成無B27的NB的培養(yǎng)液一天，后吸棄原培養(yǎng)液，換成溫暖的含糖D-Hank's液，置入CO2培養(yǎng)箱，180min后換成NB完全培養(yǎng)液(不加B27)繼續(xù)孵育至預(yù)定時間。
　　2.低糖低氧再灌注損傷組無糖D-Hank's液預(yù)先放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱(95％N2/5％CO2)中30min，使氧的濃度＜1％。神經(jīng)元以無糖D-Hank's液清洗4次，每次為原培養(yǎng)

8、液體積的2/3，使葡萄糖終濃度小于1mM。換無糖D-Hank's后將神經(jīng)元放入?yún)捬豕迌?nèi)，自開始換液計時至180min，吸棄無糖D-Hank's，換以NB完全培養(yǎng)液(不加B27)，置入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育至預(yù)定時間，以此模擬體內(nèi)缺血再灌注的過程。
　　3.低濃度乙酰葛根素組換無糖D-Hank's液及OGD結(jié)束改為NB完全培養(yǎng)液(不加B27)均時添加入乙酰葛根素，使終濃度為0.1μM，其余處置同2組。
　　4.中濃度乙酰葛根素組

9、換無糖D-Hank's液及OGD結(jié)束改為NB完全培養(yǎng)液(不加B27)均時添加入乙酰葛根素，使終濃度為0.4μM，其余處置同2組。
　　5.高濃度乙酰葛根素組換無糖D-Hank's液及OGD結(jié)束改為NB完全培養(yǎng)液(不加B27)均時添加入乙酰葛根素，使終濃度為1.6μM，其余處置同2組。
　　在OGR-12h、24h和36h分別采用倒置顯微鏡，MTT法和DAPI法動態(tài)的觀測了不同時間段中神經(jīng)元形態(tài)、活力及神經(jīng)元發(fā)生凋亡的變化，在

10、對上述檢測方法重復(fù)三次測量并統(tǒng)計分析結(jié)果后選擇OGD/R-24h作為后續(xù)實驗的主要時間點;
　　OGD/R-24h，采用末端脫氧核苷酸酶轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的duTP缺口末端標(biāo)記術(shù)(TUMEL)法檢測神經(jīng)元發(fā)生凋亡的狀況并觀察不同濃度的乙酰葛根素對神經(jīng)元凋亡的影響;
　　結(jié)果
　　1.神經(jīng)元經(jīng)OGD處理再灌注12，24h及36h，光學(xué)顯微鏡下觀察，神經(jīng)元胞體的折光性下降，軸突縮短，甚至消失，部分胞體溶解，僅可見散在的細胞核。加入

11、0.1μM，0.4μM和1.6μM的乙酰葛根素則能明顯改善OGD/R對神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)損傷，減少受損神經(jīng)元數(shù)目，表明乙酰葛根素對缺糖缺氧引起的神經(jīng)元損傷具有保護作用。
　　2.在體外OGD/R-12h，24h及36h可直接引起神經(jīng)元損傷，MTT法檢測神經(jīng)元的活力降低，0.1μM，0.4μM和1.6μM的乙酰葛根素對體外OGD/R引起胎鼠海馬神經(jīng)元的損傷有保護作用，可提高神經(jīng)細胞的活力，高濃度組的乙酰葛根素效力明顯優(yōu)于中濃度和低濃度組

12、。
　　3.DAPI染色法顯示，OGD/R-12h，24h及36h后，神經(jīng)元中染色質(zhì)固縮，向外周集聚并呈成顆粒狀的凋亡細胞數(shù)明顯增多。高，中和低濃度的乙酰葛根素對OGD/R-12h均無保護作用，OGD/R-24h和36h二個時間點中，0.4μM和1.6μM的乙酰葛根素能降低凋亡的陽性細胞數(shù)，但0.1μM的乙酰葛根素未能顯示有保護作用，并且，統(tǒng)計結(jié)果顯示，在OGD/R-24h，DAPI陽性細胞數(shù)達到最高峰，超過24h，DAPI染色的

13、陽性細胞數(shù)逐漸減小，故本實驗選擇OGD/R-24h作為后續(xù)指標(biāo)的主要觀測時間點。
　　4.OGD/R-24h可引起海馬神經(jīng)元發(fā)生凋亡，凋亡指數(shù)升高。TUNEL法顯示0.1μM，0.4μM和1.6μM的乙酰葛根素能顯著降低神經(jīng)元中凋亡陽性細胞數(shù)，使得細胞凋亡指數(shù)下降，顯示了對缺氧缺糖神經(jīng)元的保護作用。
　　結(jié)論
　　1.不同時間段的OGD/R可使體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元受損，活力下降，并可致神經(jīng)元發(fā)生凋亡，凋亡發(fā)生的高峰時間

14、為OGD/R-24h。
　　2.乙酰葛根素可以減輕神經(jīng)元的損傷，提高神經(jīng)元的活力，維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性
　　3.乙酰葛根素在0.1μM，0.4μM和1.6μM的濃度可減少凋亡的陽性細胞數(shù)，顯示其對缺氧缺糖再灌注損傷的保護作用。
　　第二部分:乙酰葛根素對糖氧剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)因子的影響
　　目的
　　利用第一部分實驗篩選出的藥物效應(yīng)時間點，從分子水平檢測乙酰葛根素對凋亡相關(guān)因子變化的影響，為一線乙

15、酰葛根素臨床治療腦缺血再灌注損傷提供實驗依據(jù)。
　　方法
　　神經(jīng)元的體外培養(yǎng)及模型建立同第一部分。實驗時間點為OGD/R-6h，24h。實驗分組為低糖低氧再灌注損傷組，低濃度乙酰葛根素組，中濃度乙酰葛根素組，高濃度乙酰葛根素組。
　　OGD/R-6h，采用熒光分光光度法觀察caspase-8活力的變化及加入乙酰葛根素后蛋白水解酶活力的改變;
　　OGD/R-24h采用熒光分光光度法觀察caspase-3活力的變

16、化及加入乙酰葛根素后此種蛋白水解酶活力的改變;
　　OGD/R-24h，處理后的神經(jīng)元經(jīng)離心收集蛋白，運用免疫印跡法檢查神經(jīng)元缺氧缺糖損傷后凋亡相關(guān)蛋白Fas-L，F(xiàn)ADD，TNF-α及Hsp70的變化及添加乙酰葛根素后對上述蛋白水平的影響;
　　OGD/R-24h，利用半定量RT-PCR法檢測HIF-1αmRNA，NF-κBmRNA和P53mRNA的表達和乙酰葛根素的影響。
　　結(jié)果
　　1.0.1μM，0.4

17、μM和1.6μM的乙酰葛根素能改善OGD/R引起的胎鼠海馬神經(jīng)元中caspase活力的變化。熒光分光光度法中，OGD/R-6h使得caspase-8蛋白水解酶的活力顯著升高，而不同濃度的乙酰葛根素組可使升高的caspase-8活力下降。OGD/R-24h，Caspase-3的活力升高，與對照組相比，低、中和高濃度的乙酰葛根素使得升高的Caspase-3活力不同程度的降低。
　　2.OGD/R-24h，海馬神經(jīng)元中Fas-L，F(xiàn)AD

18、D和TNF-α表達量增高，免疫印跡法顯示Fas-L，F(xiàn)ADD和TNF-α條帶面積及灰度均升高。加入不同濃度的乙酰葛根素后，結(jié)果顯示上述蛋白的合成均減少，顯示對OGD/R-24h后神經(jīng)元的保護作用。
　　3.乙酰葛根素能增強海馬神經(jīng)元抗損傷的能力。OGD/R-24h，Hsp70合成增加，不同濃度的乙酰葛根素使得的Hsp70升高更加明顯。
　　4.OGD/R-24h可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細胞表達HIF-1αmRNA，NF-κBmRNA和

19、P53mRNA的表達增加。加入0.1μM，0.4μM和1.6μM的乙酰葛根素后24小時行半定量RT-PCR，電泳結(jié)果顯示HIF-1αmRNA，NF-κBmRNA和P53mRNA條帶面積及灰度均降低，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明乙酰葛根素可以使OGD/R-24h誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細胞增加HIF-1αmRNA，NF-κBmRNA和P53mRNA的表達減少。
　　結(jié)論
　　不同時間段的OGD/R可使體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元受損，Caspase-

20、3及Caspase-8的活力升高，F(xiàn)as-L，F(xiàn)ADD和TNF-α的蛋白合成增加，Hsp70的蛋白合成降低，HIF-1αmRNA，NF-κBmRNA和P53mRNA的表達升高，導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。乙酰葛根素可以減輕神經(jīng)元的損傷，0.1μM，0.4μM和1.6μM的乙酰葛根素可使升高的Caspase-3及Caspase-8的活力降低，F(xiàn)as-L，F(xiàn)ADD和TNF-α的蛋白合成下降，Hsp70的蛋白合成升高，并減少HIF-1αmRNA，NF