BNIP3-AIF-Endo G通路介導(dǎo)氧葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元死亡.pdf

1、腦血管病發(fā)病率高，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康。腦中風(fēng)是目前最常見(jiàn)的危及人類(lèi)生命的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是當(dāng)今第三大死亡原因及首位致殘?jiān)?。腦缺血損傷所致的神經(jīng)元大量死亡是導(dǎo)致中風(fēng)后神經(jīng)功能喪失的主要原因，而目前仍未闡明缺血性腦損傷的機(jī)制，臨床上也缺乏有效的治療手段。因此，研究缺血性神經(jīng)元死亡機(jī)制，探索新的治療靶點(diǎn)將具有重要意義. 大量證據(jù)表明，多種機(jī)制參與了缺血性神經(jīng)細(xì)胞死亡，其中包括壞死、凋亡。壞死是一種非程序性快速死亡，而神經(jīng)元凋亡則是一種高

2、度調(diào)節(jié)的程序性死亡，過(guò)程較慢，并且該死亡過(guò)程是可以通過(guò)治療干預(yù)來(lái)逆轉(zhuǎn)的。典型性神經(jīng)元凋亡是通過(guò)激活caspases，造成細(xì)胞核和胞漿底物的降解及細(xì)胞的分解。除此之外，中風(fēng)后的腦組織中仍廣泛存在另外一種具有不同生化特點(diǎn)的神經(jīng)細(xì)胞死亡形式，這種細(xì)胞死亡也是程序性死亡，但不依賴于caspase的激活，稱為非典型性凋亡。國(guó)際上對(duì)腦缺血激活的caspase依賴性神經(jīng)元凋亡通路進(jìn)行了大量而深入的研究，對(duì)其分子機(jī)理已有了比較明確的認(rèn)識(shí)，然而，目前對(duì)非

3、典型性凋亡的分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。 Bcl-2家族眾多成員參與了細(xì)胞損傷過(guò)程。其中BNIP3（Bcl-2/E1B-19K相互作用蛋白3）是一種對(duì)缺氧最敏感的Bcl-2促凋亡蛋白。Bcl-2家族大多成員均含有為其線粒體定位及誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所需的BH3結(jié)構(gòu)域和C末端跨膜結(jié)構(gòu)域。BNIP3也含有BH3結(jié)構(gòu)域，但該結(jié)構(gòu)域既不是BNIP3與其他Bcl-2家族成員形成異二聚體所必須的，也不是BNIP3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需的，這表明BNIP3不

4、同于其他Bcl-2家族蛋白。研究進(jìn)一步表明，BNIP3誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的特點(diǎn)是早期質(zhì)膜通透性增加，線粒體損傷，但不伴隨caspase的激活及細(xì)胞色素c的釋放。雖然目前對(duì)caspase依賴性細(xì)胞死亡通路的機(jī)理已有了比較明確的認(rèn)識(shí)，然而，對(duì)非典型性凋亡的特點(diǎn)及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明了。由于BNIP3對(duì)缺氧的敏感性以及其誘導(dǎo)非典型性凋亡的特點(diǎn)，我們研究了其在缺血性神經(jīng)元死亡中的作用及其下游機(jī)制。 首先我們用體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元氧葡萄糖剝奪（O

5、GD）/復(fù)氧（R）模型模擬腦缺血來(lái)觀察OGD/R過(guò)程中BNIP3的變化。取培養(yǎng)12天生長(zhǎng)良好的海馬神經(jīng)元分成三組：control組，不進(jìn)行任何處理；EBSS組，將Neurobasal培養(yǎng)基換成EBSS平衡液，正常孵育4h后再換回Neurobasal培養(yǎng)基孵育24 h，設(shè)計(jì)此組的目的是為了排除由于換液操作引起的細(xì)胞損傷；OGD/R組：將Neurobasal培養(yǎng)基換成無(wú)糖EBSS平衡液，缺氧孵箱中（1%O2）孵育4 h后再換回Neuroba

6、sal培養(yǎng)基正常孵育24 h。結(jié)果顯示：control組和EBSS組細(xì)胞死亡率分別為10.65±2.69%和10.16±2.94%（p>0.05），而OGD/R組細(xì)胞死亡率達(dá)到37.71±6.80%（p<0.01）。并且control組和EBSS組細(xì)胞活性百分率分別為100.00±6.96%和96.31±6.91%（p>0.05），而OGD/R組則降至46.94±7.02%（p<0.01）?？梢?jiàn)OGD（4h）/R（24 h）引起明顯的細(xì)

7、胞損傷。那么在OGD/R過(guò)程中BNIP3表達(dá)是否發(fā)生變化以及是如何變化的，我們又分別觀察了復(fù)氧后0h，2h，6h，12 h，24 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BNIP3的表達(dá)，全細(xì)胞Western Blot結(jié)果顯示：20 KD BNIP3（前體蛋白形式）在OGD/R0h即升高至對(duì)照組的2.36±0.33倍，（p<0.01）：30 KD（單體形式）和60 KD（二聚體形式）的BNIP3在OGD/R2 h分別升高至對(duì)照組的3.50±0.46倍和1.84±0

8、.31倍，（p<0.01），三種形式的BNIP3均隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并在OGD/R12 h達(dá)到最高值。因?yàn)锽NIP3主要是通過(guò)形成同二聚體插入到線粒體上發(fā)揮其促凋亡功能，我們又進(jìn)一步觀察了亞細(xì)胞器線粒體上BNIP3的變化。結(jié)果顯示：20 KD和60 KD的BNIP3在復(fù)氧后0h即升高至對(duì)照組的2.14±0.23倍和3.42±0.31倍（p<0.01），并隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)增加，在OGD/R24 h達(dá)到最高。而30 KD的BNIP3

9、在線粒體上基本觀察不到。為了驗(yàn)證升高的BNIP3是否參與細(xì)胞損傷，我們觀察過(guò)表達(dá)BNIP3對(duì)細(xì)胞死亡的影響。結(jié)果顯示：對(duì)照組細(xì)胞死亡率為22.86±6.82%，而過(guò)表達(dá)BNIP3可引起細(xì)胞死亡率升高至62.46±9.62%（p<0.01），表明過(guò)表達(dá)BNIP3可引起細(xì)胞損傷。并且抑制BNIP3可以使OGD/R12 h后的細(xì)胞死亡率由對(duì)照組的32.87±1.80%降至18.07±1.46%（p<0.01）及OGD/R24 h后的細(xì)胞死亡率

10、由37.25±2.15%降至16.02±1.21%（p<0.01）。以上實(shí)驗(yàn)均證明BNIP3參與了OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 BNIP3介導(dǎo)caspase非依賴性細(xì)胞凋亡途徑的下游機(jī)制尚不明確。研究表明，Endo G（核酸內(nèi)切酶G）和AIF（凋亡誘導(dǎo)因子）作為線粒體功能障礙的下游分子，同樣參與了caspase非依賴性細(xì)胞死亡通路。Endo G和AIF都是線粒體蛋白。Endo G是一種線粒體DNA酶，當(dāng)其從線粒體釋放出來(lái)之后，可

11、以轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，并且以caspase非依賴性方式將染色質(zhì)DNA剪切為核小體碎片。AIF是一種含氧化還原酶結(jié)構(gòu)域的線粒體黃素蛋白，當(dāng)其從線粒體釋放出來(lái)后可與Endo G結(jié)合，共同促進(jìn)DNA降解及細(xì)胞凋亡。這是目前確定的唯一不依賴caspase活性的DNA降解通路。我們研究了Endo G和AIF是否作為BNIP3的下游分子介導(dǎo)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。 首先，我們觀察了OGD/R過(guò)程中AIF和Endo G的變化。全細(xì)胞Western

12、 Blot結(jié)果顯示：AIF和Endo G在OGD/R6 h分別升高至對(duì)照組的1.84±0.18倍和1.54±0.18倍，（p<0.01）。隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)上調(diào)，并在OGD/R12 h最高。以往實(shí)驗(yàn)證明AIF和Endo G在細(xì)胞受到損傷后由線粒體釋放轉(zhuǎn)位到核上發(fā)揮促凋亡功能，我們又進(jìn)一步分別觀察OGD/R后AIF和Endo G的核轉(zhuǎn)位。結(jié)果顯示：線粒體AIF和Endo G在OGD/R2 h表達(dá)分別降至對(duì)照組0.63±0.12倍和0.5

13、8±0.80倍，（p<0.01），并隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)增加，在OGD/R24 h降至最低；而相應(yīng)核中AIF和Endo G在OGD/R2 h表達(dá)分別升高至對(duì)照組的1.60±0.11倍和3.62±0.41倍（p<0.01），在OGD/R12 h最高。說(shuō)明OGD/R過(guò)程中AIF和Endo G可能由線粒體轉(zhuǎn)位到核。為進(jìn)一步研究AIF/Endo G核轉(zhuǎn)位和細(xì)胞死亡之間的關(guān)系，我們分別觀察了OGD/R后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的核轉(zhuǎn)位率和細(xì)胞死亡率，結(jié)果證明OGD

14、/R12 h細(xì)胞死亡率具有顯著性差異，而AIF和Endo G的核轉(zhuǎn)位在OGD/R2h即呈現(xiàn)顯著性差異，提前于細(xì)胞死亡之前，表明AIF和Endo G核轉(zhuǎn)位發(fā)生在細(xì)胞死亡之前，提示AIF和EndoG核轉(zhuǎn)位可能是細(xì)胞損傷的誘導(dǎo)因素而不是伴隨現(xiàn)象。 其次，為研究BNIP3和AIF/Endo G核轉(zhuǎn)位的關(guān)系，我們過(guò)表達(dá)BNIP3來(lái)觀察對(duì)AIF/Endo G核轉(zhuǎn)位的影響。結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)BNIP3可以引起核AIF轉(zhuǎn)位由對(duì)照組的30.44±5

15、.57%升高到70.12±7.51%（p<0.01）；核Endo G轉(zhuǎn)位由25.92±3.99%升高到60.01±8.51%（p<0.01）?？梢?jiàn)過(guò)表達(dá)BNIP3可以誘導(dǎo)AIF和Endo G發(fā)生核轉(zhuǎn)位。并且抑制BNIP3表達(dá)也得出一致的結(jié)論，抑制BNIP3表達(dá)可以使OGD/R2 h后AIF核轉(zhuǎn)位由24.58±3.39%降低到12.5±3.66%（p<0.01），使OGD/R6 h由51.67±5.60%降低到29.29±6.74%（p<

16、0.01）。以上實(shí)驗(yàn)均證明AIF/Endo G可能是BNIP3的下游分子。 再次，我們?cè)趤?lái)源于Harlequin（Hq）C57小鼠的海馬神經(jīng)元上再次對(duì)AIF是否是BNIP3的下游分子進(jìn)行驗(yàn)證。這種小鼠AIF表達(dá)降低大約80%。過(guò)表達(dá)BNIP3可以引起野生型C57海馬神經(jīng)元死亡率由對(duì)照組的2.13±5.32%升高到58.86±6.50%，但僅引起Hq C57海馬神經(jīng)元死亡由對(duì)照組的23.25±4.95%升高到35.38±6.19%

17、，升高的幅度有了明顯降低（p<0.01）?？梢?jiàn)下調(diào)AIF降低過(guò)表達(dá)BNIP3引起的細(xì)胞死亡，進(jìn)一步證明AIF是BNIP3的下游分子。并且AIF下調(diào)并不影響B(tài)NIP3的表達(dá)，OGD（4 h）/R（24 h）后仍可見(jiàn)BNIP3表達(dá)升高。OGD/R不能誘導(dǎo)Hq C57海馬神經(jīng)元出現(xiàn)顯著性死亡，表明在OGD/R中AIF是一個(gè)重要的下游分子。 綜上所述，OGD/R引起B(yǎng)NIP3表達(dá)升高并插入到線粒體上，繼而誘導(dǎo)AIF和Endo G由線粒體