2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),對(duì)維持正常腦功能至關(guān)重要,但突觸間隙過(guò)高濃度的谷氨酸同時(shí)具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。腦缺血和再灌注后,谷氨酸的過(guò)度釋放或谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)谷氨酸清除不足可導(dǎo)致谷氨酸在突觸間隙中堆積,突觸間隙過(guò)量的谷氨酸作用于神經(jīng)元突觸后膜的離子型和代謝型谷氨酸受體,可引發(fā)興奮性毒性,例如鈣超載,鈉超載,自由基產(chǎn)生和凋亡等。腦內(nèi)細(xì)胞外沒(méi)有代謝谷氨酸的酶,腦內(nèi)細(xì)胞外谷氨酸的清除主要依靠高親和力興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)(ex

2、citatory amino acid transporters,EAATs)來(lái)維持。膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glial glutamate transporter-1,GLT-1)在清除細(xì)胞外谷氨酸中的作用最為重要。多種證據(jù)表明,腦缺血預(yù)處理或藥物可以通過(guò)上調(diào) GLT-1的表達(dá)及增強(qiáng)GLT-1對(duì)谷氨酸的攝取活性,對(duì)神經(jīng)元的缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用。
  Rothstein等報(bào)道,在體實(shí)驗(yàn)中,β-內(nèi)酰胺抗生素如頭孢曲松可選擇性地促進(jìn)

3、GLT-1在腦內(nèi)的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中,頭孢曲松可顯著激活人胎兒星形膠質(zhì)細(xì)胞或COS7細(xì)胞系中的GLT-1啟動(dòng)子,進(jìn)而促進(jìn)GLT-1的上調(diào)。但大量使用β-內(nèi)酰胺抗生素,會(huì)帶來(lái)例如菌群失調(diào)和細(xì)菌耐藥性等多種副作用。舒巴坦是一種非典型的β-內(nèi)酰胺抗生素,抗菌能力很弱,臨床上常作為其它β-內(nèi)酰胺類抗生素的增效劑。我室最近的研究表明,在大鼠全腦缺血模型中,舒巴坦預(yù)防性給藥,可以通過(guò)上調(diào)海馬CA1區(qū)GLT-1的表達(dá)減輕錐體神經(jīng)元的缺血性損傷。這些發(fā)現(xiàn)

4、為應(yīng)用舒巴斯坦預(yù)防和治療腦缺血損傷的臨床研究提供了有益的基礎(chǔ)和參考。然而,在體實(shí)驗(yàn)很難證明舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的直接作用,因此有必要利用星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),體外研究舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的直接作用。此外,進(jìn)一步研究舒巴坦上調(diào)GLT-1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可更好地理解舒巴坦在腦內(nèi)的作用,促進(jìn)舒巴坦作為抗腦缺血藥物的臨床開(kāi)發(fā)和應(yīng)用研究。
  p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated

5、proteinkinases,p38 MAPK)是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),參與一系列生理和病理過(guò)程,包括細(xì)胞死亡和存活。p38 MAPK的激活如一把雙刃劍,p38 MAPK的過(guò)度激活可促進(jìn)腦缺血后的神經(jīng)元死亡,但也有充分證據(jù)表明p38 MAPK的適度激活對(duì)缺血組織器官的保護(hù)作用。我室最新研究表明,全腦缺血預(yù)處理可誘導(dǎo)大鼠海馬CA1區(qū)p38 MAPK適度激活,同時(shí)p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580或反義寡核苷酸可抑制全腦

6、缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受和海馬CA1區(qū)GLT-1上調(diào)。這些研究結(jié)果表明,p38 MAPK的適度激活可能介導(dǎo)GLT-1表達(dá)的上調(diào),并誘導(dǎo)腦缺血耐受。
  因此,本實(shí)驗(yàn)旨在研究 p38 MAPK信號(hào)通路在舒巴坦誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)上調(diào)和抗氧葡萄糖剝奪(oxygen glucose deprivation,OGD)模擬缺血損傷過(guò)程中的作用。
  第一部分:舒巴坦發(fā)揮抗氧葡萄糖剝奪引起的海馬神經(jīng)元死亡和上調(diào)海馬

7、星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的作用
  目的:
  應(yīng)用神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),觀察舒巴坦對(duì)OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡的影響,探討舒巴坦的抗OGD引起的神經(jīng)元損傷作用。應(yīng)用單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),通過(guò)觀察在OGD狀態(tài)下,舒巴坦預(yù)孵育對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的影響,證明星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)上調(diào)在舒巴坦抗OGD中的作用。
  方法:
  為觀察舒巴坦對(duì)OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡的影響,取24 h內(nèi)新生

8、鼠海馬行神經(jīng)元星型膠質(zhì)共培養(yǎng)10天后,細(xì)胞隨機(jī)分為4組;為觀察舒巴坦預(yù)孵育對(duì)OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的影響,取1-2天新生鼠海馬行單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),并將細(xì)胞傳至3-4代,最后一代細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后,將細(xì)胞隨機(jī)分為3組(4組中的前3組),4組如下:
  (1)對(duì)照組:正常培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h+2 h+24 h,以上時(shí)間段分別對(duì)應(yīng)下面實(shí)驗(yàn)分組中實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間段,48 h對(duì)應(yīng)舒巴坦孵育的時(shí)間段,2 h對(duì)應(yīng)OGD的時(shí)間段,24

9、 h對(duì)應(yīng)OGD復(fù)氧后至收集細(xì)胞的時(shí)間段。
  (2)OGD組:首先細(xì)胞正常培養(yǎng)48 h后(對(duì)應(yīng)下一組舒巴坦孵育時(shí)間段),進(jìn)行2 h的OGD后,更換為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
  (3)舒巴坦+OGD組:共培養(yǎng)細(xì)胞用加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48 h,之后行OGD,方法同OGD組。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,用NS代替舒巴坦。根據(jù)舒巴坦的劑量,進(jìn)一步分為5μM,25μM和125μM3個(gè)亞組,以觀察其量效關(guān)系。
  (4)舒巴坦對(duì)照

10、組:這一實(shí)驗(yàn)組只用于共培養(yǎng)中,觀察細(xì)胞存活情況。培養(yǎng)基中加入舒巴坦生理鹽溶液(100×),在舒巴坦終濃度為125μM下孵育48小時(shí),換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
  共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后24 h或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,赫克斯特/碘化丙啶(hoechst/propidium iodide, HO/PI)染色法觀察計(jì)數(shù)神經(jīng)元死亡百分率,MTT法觀察細(xì)胞活力,分析舒巴坦對(duì)OGD所致的海馬神經(jīng)元死亡及損傷的影響。單純星

11、形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后12 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集星形膠質(zhì)細(xì)胞,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot兩種方法觀察舒巴坦對(duì)OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的影響。
  結(jié)果:
  1.HO/PI染色顯示,對(duì)照組死亡細(xì)胞百分比是9.2±0.5%。2 h OGD可以使死亡細(xì)胞的百分比增加到71.6±2.4%,與對(duì)照組相比,死亡細(xì)胞的百分比明顯提高;而且明場(chǎng)照片與 HO/PI染色熒光圖片合成后

12、可以看出,死亡細(xì)胞主要為神經(jīng)元,說(shuō)明2 h的OGD可以使神經(jīng)元的死亡百分率明顯提高。舒巴坦預(yù)孵育可以劑量依賴地降低海馬神經(jīng)元的死亡率,125μM的舒巴坦具有最好的藥效,125μM的舒巴坦預(yù)孵育可以將死亡細(xì)胞的百分比降低至15.6±1.0%。NS溶劑對(duì)照組與OGD組相比,死亡細(xì)胞的百分比無(wú)明顯差異,說(shuō)明溶劑不能改變OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡。以上結(jié)果共同說(shuō)明,2 h的OGD可以明顯增加神經(jīng)元的死亡,而舒巴坦有效的阻止了OGD引起的海馬神經(jīng)

13、元死亡,此效應(yīng)呈現(xiàn)良好的劑量依賴性。與對(duì)照組相比,舒坦坦對(duì)照組中,正常共培養(yǎng)中加入最大濃度125μM的舒巴坦并未引起死亡細(xì)胞的百分比的改變,說(shuō)明最大濃度125μM的舒巴坦無(wú)明顯損傷作用。
  2.MTT檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比,2 h的OGD可顯著降低共培養(yǎng)的細(xì)胞活力;而48 h的舒巴坦預(yù)孵育可以劑量依賴地增加共培養(yǎng)的細(xì)胞活力,并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。舒巴坦對(duì)照組的細(xì)胞活力與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯差異,說(shuō)明最大濃度125μM的

14、舒巴坦無(wú)明顯損傷作用。
  以上結(jié)果表明,舒巴坦可劑量依賴的對(duì)抗氧葡萄糖剝奪引起海馬神經(jīng)元死亡和損傷。
  3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在對(duì)照組,GLT-1廣泛表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比,OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào),約為正常組的1/2-2/3。與OGD組相比,舒巴坦預(yù)孵育可以顯著上調(diào)OGD處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá),這種上調(diào)呈明顯的劑量依賴性,最大劑量125μM舒巴坦可使其表達(dá)增加至對(duì)照組的1.5-2倍,

15、OGD組的2-3倍,并且這種上調(diào)可持續(xù)到OGD后24 h,這一時(shí)間覆蓋了OGD后神經(jīng)元死亡的時(shí)間,有利于其發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。與OGD組相比,舒巴坦的溶劑對(duì)照組GLT-1的表達(dá)無(wú)明顯變化。
  4.Western blot結(jié)果顯示:對(duì)照組GLT-1有一定的基礎(chǔ)表達(dá)。與對(duì)照組相比,OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào)。與OGD組相比,舒巴坦+OGD組 GLT-1的表達(dá)明顯上調(diào),呈劑量依賴性,且表達(dá)上調(diào)時(shí)間可持續(xù)到到OGD復(fù)氧后24 h。

16、與OGD組相比,舒巴坦的溶劑對(duì)照組GLT-1的表達(dá)無(wú)明顯變化。
  小結(jié):
  舒巴坦可劑量依賴的引起星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá)的持續(xù)上調(diào),這種上調(diào)可能是共培養(yǎng)中舒巴坦對(duì)抗OGD引起神經(jīng)元死亡的機(jī)制之一。
  第二部分 舒巴坦序列上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK和GLT-1的表達(dá)
  目的:
  1.觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞 GLT-1、p-p38 MAPK和總 p38 MAPK表達(dá)的影響。

17、>  2.比較舒巴坦上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1和p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程。
  方法:
  行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),純化并傳至3-4代,最后1代細(xì)胞布滿瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。
  1.為觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的劑量依賴性,用終濃度為5μM,25μM和125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于孵育48 h后收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞

18、GLT-1表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
  2.為觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程,用終濃度為125μM舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于舒巴坦孵育1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h和72 h時(shí)收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察舒巴坦的不同孵育時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞 GLT-1表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。

19、  3.為觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞 p-p38 MAPK表達(dá)的劑量依賴性,用終濃度為5μM,25μM和125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于孵育48 h后收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)的影響;于孵育24 h后收集細(xì)胞,觀察不同劑量的舒巴坦對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞總p38 MAPK表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
  4.觀察

20、舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程,用終濃度為125μM舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,于舒巴坦孵育1 h,3 h,6 h,12 h,24 h,48 h和72 h時(shí)收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法觀察舒巴坦的不同孵育時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK和總p38 MAPK表達(dá)的影響。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,培養(yǎng)液中只加入舒巴坦的溶劑NS。
  結(jié)果:
  1.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞

21、 GLT-1表達(dá)的劑量依賴性實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在溶劑對(duì)照組,GLT-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。應(yīng)用舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞48 h,與對(duì)照組相比,5μM,25μM和125μM的舒巴坦顯著增加GLT-1的表達(dá),這種上調(diào)呈劑量依賴性。Western blot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。
  2.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在125μM的舒巴坦孵育后,與溶劑對(duì)照

22、組相比, GLT-1的表達(dá)從舒巴坦孵育12 h開(kāi)始增加,48 h達(dá)到高峰,72 h仍維持在與較高水平。Western blot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。
  3.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞p-p38 MAPK表達(dá)的劑量依賴性實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在溶劑對(duì)照組,p-p38 MAPK主要表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核,細(xì)胞漿也有少量表達(dá),主要存在于細(xì)胞核周圍,且染色較淺,表達(dá)量較少;p38主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞

23、漿,并有大量表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot法檢測(cè)均顯示:應(yīng)用舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞3 h,與對(duì)照組相比,5μM,25μM和125μM的舒巴坦均顯著增加p-p38 MAPK的表達(dá),且這種上調(diào)呈劑量依賴性。在舒巴坦組,應(yīng)用5μM,25μM和125μM舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h后,p38的表達(dá)與溶劑對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。Western blot分析顯示與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相同。
  4.在觀察舒巴坦對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞GL

24、T-1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中,免疫細(xì)胞化學(xué)和 Western blot法檢測(cè)結(jié)果均顯示,在溶劑對(duì)照組,p-p38 MAPK有少量的表達(dá);在舒巴坦組,應(yīng)用125μM的舒巴坦孵育正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞,與溶劑對(duì)照組相比,p-p38 MAPK的表達(dá)從舒巴坦孵育1 h開(kāi)始增加,3 h達(dá)到高峰,24 h恢復(fù)到對(duì)照基礎(chǔ)水平。在舒巴坦組,應(yīng)用125μM的舒巴坦孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞,總p38 MAPK的表達(dá)在任何時(shí)間點(diǎn)與溶劑對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異。

25、  小結(jié):
  1.舒巴坦可上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá),這種上調(diào)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性,舒巴坦孵育12 h開(kāi)始增加,48 h達(dá)到高峰,72 h仍維持在與較高水平。
  2.舒巴坦可上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的p-p38 MAPK表達(dá),這種上調(diào)具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性,且舒巴坦對(duì)總p38 MAPK的表達(dá)無(wú)影響, p-p38 MAPK的上調(diào)為p38 MAPK的磷酸化激活所致。p-p38 MAPK的上調(diào)從舒巴坦孵育1h開(kāi)

26、始增加,3h達(dá)到高峰,24h恢復(fù)到對(duì)照基礎(chǔ)水平。
  第三部分:抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦引起的正常和OGD-處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)
  目的:
  應(yīng)用單純星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),觀察 p-p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)正常和OGD-處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)的影響,探討p-p38 MAPK通路是否參與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1的上調(diào)。
  方法:<

27、br>  1.行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),純化并傳至3-4代,最后1代細(xì)胞布滿瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞隨機(jī)分為以下4組:
  (1)對(duì)照組:正常的星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h+48 h,相當(dāng)于SB203580與舒巴坦的共同孵育時(shí)間。
  (2)舒巴坦組:在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h后,換成終濃度為125μM舒巴坦的培養(yǎng)液中孵育48 h。
  (3)SB203580+舒巴坦組:首先正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入SB2035

28、80孵育1 h,再加入終濃度為125μM的舒巴坦與SB203580共同孵育48 h,根據(jù)SB203580的不同劑量分為2.5μM,5μM和10μM三個(gè)亞組。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,用DMSO代替SB203580。
  (4)SB203580對(duì)照組:用終濃度為10μM的SB203580孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞1 h+48 h。
  收集以上各組的星形膠質(zhì)細(xì)胞后,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和 western blot兩種方法觀察各組GLT-1的表達(dá)

29、,分析抑制p-p38 MAPK通路對(duì)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)的影響。
  2.行星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),純化并傳至3-4代,最后1代細(xì)胞布滿瓶底時(shí)用于實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞隨機(jī)分為以下4組:
  (1)對(duì)照組:正常星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中孵育1 h+48 h+2 h,(相當(dāng)于SB203580先單獨(dú)孵育1 h、舒巴坦和SB203580共同孵育時(shí)間48 h和OGD的時(shí)間2 h),換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h收

30、集細(xì)胞。
  (2)OGD組:首先星形膠質(zhì)細(xì)胞正常培養(yǎng)1 h+48 h后,進(jìn)行2 h的OGD后,換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h或24 h收集細(xì)胞。
  (3)舒巴坦+OGD組:星形膠質(zhì)細(xì)胞在正常的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h,加入終濃度為125μM舒巴坦培養(yǎng)液中孵育48 h,其余步驟同OGD組。
  (4)SB203580+舒巴坦+OGD組:正常星形膠質(zhì)細(xì)胞首先在終濃度為2.5μM,5μM和10μM的SB203580的培養(yǎng)基中孵

31、育1 h,再加入舒巴坦使其終濃度為125μM,并與SB203580共同孵育48 h,其余步驟同OGD組,同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組,用DMSO代替SB203580。
  實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后12 h或24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)及對(duì)照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot法,觀察各組GLT-1的表達(dá),分析抑制p-p38 MAPK通路對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)OGD處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1上調(diào)的影響。
  結(jié)果:

32、>  1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在對(duì)照組,GLT-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的單純星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比,舒巴坦組應(yīng)用125μM舒巴坦孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后,GLT-1的表達(dá)顯著上調(diào)。與舒巴坦組相比,SB203580+舒巴坦組中應(yīng)用2.5μM,5μM,10μM的SB203580孵育,GLT-1的表達(dá)明顯下調(diào),且這種下調(diào)呈顯著的劑量依賴性。溶劑對(duì)照組,與舒巴坦組相比GLT-1的表達(dá)無(wú)明顯改變。與對(duì)照組相比,SB203580對(duì)照組中,用10μM的SB

33、203580孵育正常星形膠質(zhì)細(xì)胞,GLT-1的基礎(chǔ)表達(dá)無(wú)明顯改變。
  2.Western blot的結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致。與對(duì)照組相比,舒巴坦組的GLT-1表達(dá)顯著上調(diào)。與舒巴坦組相比,SB203580+舒巴坦組的GLT-1表達(dá)劑量依賴性的顯著下調(diào)。在 SB203580的溶劑對(duì)照組, SB203580的溶劑對(duì)舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)無(wú)影響。在SB203580對(duì)照組中,10μM的SB203580對(duì)基礎(chǔ)表達(dá)的GLT-1無(wú)明顯

34、影響。Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果共同說(shuō)明,SB203580劑量依賴的抑制舒巴坦誘導(dǎo)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的上調(diào)。
  3.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示:在對(duì)照組,GLT-1廣泛表達(dá)于培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。與對(duì)照組相比,OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào),約為正常對(duì)照組的1/2-2/3。在舒巴坦+OGD組,與OGD組相比,125μM的舒巴坦預(yù)孵育48 h后,可以顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1表達(dá),其表達(dá)是正常水平的1

35、.5-2倍。在SB203580+舒巴坦+OGD組,與舒巴坦+OGD組相比,2.5μM,5μM和10μM的SB203580可以顯著抑制舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞 GLT-1的上調(diào),這種抑制作用呈劑量依賴性,10μM的SB203580表現(xiàn)出最好的抑制效果。單獨(dú)加入SB203580的溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的上調(diào)無(wú)影響。
  4.Western blot法檢測(cè)結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果相一致,結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比

36、,OGD組的GLT-1表達(dá)明顯下調(diào)。在舒巴坦+OGD組,與OGD組相比,舒巴坦可以顯著上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá);與舒巴坦+OGD組相比,SB203580+舒巴坦+OGD組的GLT-1的表達(dá)上調(diào)被顯著抑制,這種抑制呈劑量依賴性。SB203580的溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的GLT-1上調(diào)無(wú)影響。Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果共同說(shuō)明,SB203580可劑量依賴的抑制舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的上調(diào)。

37、  小結(jié):
  1.抑制 p38 MAPK通路阻斷了舒巴坦誘導(dǎo)的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的上調(diào),p38 MAPK通路參與了正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中舒巴坦誘導(dǎo)的GLT-1的上調(diào)。
  2.抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦引起的OGD處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá),p38 MAPK通路參與了舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)上調(diào)。
  第四部分 抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元抗

38、OGD作用
  目的:
  應(yīng)用神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù),觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)舒巴坦抗海馬神經(jīng)元OGD作用的影響,探討p38 MAPK通路是否參與舒巴坦誘導(dǎo)的抗OGD損傷的神經(jīng)元保護(hù)作用。
  方法:
  取24 h內(nèi)新生鼠進(jìn)行海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)10天后,將細(xì)胞隨機(jī)分為以下6組:
  (1)對(duì)照組:正常培養(yǎng)基培養(yǎng)海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞1 h+48 h+2 h+24 h,

39、以上時(shí)間段分別對(duì)應(yīng)下面實(shí)驗(yàn)分組中實(shí)驗(yàn)處理的時(shí)間段,1 h+48 h對(duì)應(yīng)SB203580孵育時(shí)間段,48 h對(duì)應(yīng)舒巴坦孵育的時(shí)間段,2 h對(duì)應(yīng)OGD的時(shí)間段,24 h對(duì)應(yīng)OGD復(fù)氧后至收集細(xì)胞的時(shí)間段。
  (2)OGD組:首先共培養(yǎng)細(xì)胞正常培養(yǎng)1+48 h后(對(duì)應(yīng)SB203580孵育時(shí)間段),進(jìn)行2 h氧葡萄糖剝奪后換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。
  (3)舒巴坦+OGD組:共培養(yǎng)細(xì)胞先正常培養(yǎng)1 h,加入舒巴坦培養(yǎng)液中孵

40、育48 h,之后行OGD,方法同OGD組。
  (4)SB203580+舒巴坦+OGD組:在含2%B27的NB培養(yǎng)基中,先加入 SB203580孵育1 h,培養(yǎng)液中加入終濃度為125μM的舒巴坦與SB203580繼續(xù)共同孵育48h,之后行OGD,方法同OGD組。根據(jù)SB203580的劑量進(jìn)一步分為2.5μM,5μM和10μM3個(gè)亞組,以觀察其量效關(guān)系。
  (5)舒巴坦對(duì)照組:先正常培養(yǎng)1 h,再加入終濃度為125μM的舒巴

41、坦孵育48小時(shí),換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
  (6)SB203580對(duì)照組:在正常培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入10μM的SB203580孵育1+48 h,換成正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h+24 h。
  實(shí)驗(yàn)各組于OGD復(fù)氧后24 h或相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,HO/PI染色觀察計(jì)數(shù)神經(jīng)元死亡百分率;MTT法觀察細(xì)胞活力,觀察p38 MAPK抑制劑SB203580對(duì)舒巴坦抗OGD發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用的影響。<

42、br>  結(jié)果:
  1.HO/PI雙重染色顯示,與對(duì)照組相比,125μM的舒巴坦單獨(dú)處理正常的共培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的死亡率無(wú)影響,2 h的OGD可以顯著增加細(xì)胞死亡率,而125μM的舒巴坦預(yù)孵育48 h可以顯著降低由OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡。與舒巴坦+OGD組相比,SB203580+舒巴坦+OGD組應(yīng)用2.5μM,5μM和10μM的SB203580后,細(xì)胞死亡率又明顯升高,這種效應(yīng)呈明顯的劑量依賴性;在SB203580的溶劑對(duì)照組

43、,共培養(yǎng)的細(xì)胞死亡率與舒巴坦+OGD組相比無(wú)明顯差異,說(shuō)明溶劑對(duì)舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗OGD而產(chǎn)生的神經(jīng)元保護(hù)作用無(wú)影響。此外,在 SB203580對(duì)照組,與對(duì)照組相比,細(xì)胞死亡率無(wú)明顯改變,說(shuō)明10μM的SB203580對(duì)正常的神經(jīng)元無(wú)損傷致死作用。
  2.MTT的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,2 h的OGD可以顯著降低共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活力,而舒巴坦可以顯著增加由OGD引起的共培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞活力降低。與舒巴坦+OGD組相比,SB20358

44、0+舒巴坦+OGD組中SB203580明顯降低共培養(yǎng)的細(xì)胞活力,且具有劑量依賴性。在SB203580的溶劑對(duì)照組,共培養(yǎng)的細(xì)胞活力與舒巴坦+OGD組相比無(wú)明顯差異。在SB203580對(duì)照組,與對(duì)照組相比,細(xì)胞活力無(wú)明顯改變。以上結(jié)果結(jié)合HO/PI結(jié)果,說(shuō)明SB203580可以劑量依賴的抑制舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗OGD而產(chǎn)生的神經(jīng)元保護(hù)作用,p-p38 MAPK通路參與了海馬神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)中舒巴坦對(duì)抗氧葡萄糖剝奪發(fā)揮的神經(jīng)元保護(hù)作用。

45、r>  小結(jié):在神經(jīng)元-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中,抑制p38 MAPK通路阻斷舒巴坦介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元抗OGD作用。
  結(jié)論:
  1.舒巴坦預(yù)孵育可劑量依賴性的對(duì)抗OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡,并可上調(diào)OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1表達(dá),同時(shí)維持GLT-1的高表達(dá)直至OGD復(fù)氧后24 h,表明舒巴坦預(yù)孵育可能通過(guò)上調(diào)并維持星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的表達(dá)對(duì)抗OGD引起的海馬神經(jīng)元死亡。
  2.舒巴坦可劑量和時(shí)間依賴性的

46、上調(diào)正常星形膠質(zhì)細(xì)胞 p-p38 MAPK和GLT-1表達(dá),且p38的磷酸化活化明顯早于GLT-1表達(dá)上調(diào)。
  3.抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦誘導(dǎo)的正常和OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞的GLT-1的上調(diào),p38 MAPK通路參與了舒巴坦預(yù)孵育誘導(dǎo)的正常和OGD后星形膠質(zhì)細(xì)胞GLT-1的表達(dá)上調(diào)。
  4.抑制p-p38 MAPK阻斷舒巴坦預(yù)孵育對(duì)抗OGD發(fā)揮的海馬神經(jīng)元保護(hù)作用。
  5.以上表明,舒巴坦通過(guò)激活星形膠

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