TNF-α調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞EAAT2的表達和對氧糖剝奪神經(jīng)元存活率的影響.pdf

1、背景
　　 急性缺血性腦梗塞以其發(fā)病率高、死亡率高而嚴重危害著人類健康。谷氨酸積聚所致的興奮毒性和炎性反應(yīng)被認為分別是腦缺血損傷的重要機制之一。腦內(nèi)清除谷氨酸的主要機制是谷氨酸轉(zhuǎn)運體EAAT將胞外谷氨酸重攝取至胞內(nèi)，以終止谷氨酸的神經(jīng)興奮作用。星形膠質(zhì)細胞膜上表達大量的EAAT2，參與了大部分的胞外谷氨酸的清除，但在缺血缺氧等條件下其功能表達會發(fā)生顯著變化，從而導(dǎo)致谷氨酸興奮性毒性。所以，探討腦缺血時何種因素導(dǎo)致EAAT2的表達

2、改變，從而通過增強EAAT2表達功能有可能促進缺血神經(jīng)元的存活。
　　 腦缺血時星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞會釋放很多細胞因子，其中腫瘤壞死因子TNF-α是主要因子之一，缺氧使TNF-α顯著增加。有文獻報道TNF-α可能參與了EAAT2的表達下調(diào)，但也有文獻提出TNF-α可以促進EAAT2的功能，分析其中的原因可能是忽略了TNF-α對膠質(zhì)增生的作用，以及缺少TNF-α的時間和濃度效應(yīng)。針對以上缺陷，本研究探討了不同濃度及作用時間的T

3、NF-α對星形膠質(zhì)細胞EAAT2以及膠質(zhì)細胞標(biāo)記物GFAP表達的影響。
　　 目的
　　 探討TNF-α調(diào)控星形膠質(zhì)細胞EAAT2表達的時間和濃度效應(yīng)；闡明TNF-α是否有可能保護缺血神經(jīng)元。
　　 方法
　　 (1)分別取SD大鼠新生鼠大腦皮層和胎鼠的海馬組織做星形膠質(zhì)細胞純培養(yǎng)和神經(jīng)元純培養(yǎng)，或者采用倒扣法將二者混合培養(yǎng)。
　　 (2)外源性TNF-α采用不同濃度和作用時間孵育星形膠質(zhì)細胞。<

4、br>　　 (3)將混合培養(yǎng)的細胞氧糖剝奪(OGD)2小時處理，再復(fù)灌24小時后做細胞活性及蛋白表達測定。
　　 (4)采用MTT檢測法測定神經(jīng)元存活度。
　　 (5)采用Western Blot法分別檢測星形膠質(zhì)細胞EAAT2和GFAP蛋白表達量的變化。
　　 結(jié)果
　　 (1)在低濃度的TNF-α作用下(≤10ng/ml)，星形膠質(zhì)細胞EAAT2的蛋白表達量隨濃度逐漸增加，在10ng/ml的TNF-

5、α作用時表達增加最顯著；但在高濃度的TNF-α作用下(≥20ng/ml)，EAAT2蛋白表達量又從高峰逐漸下降，而GFAP表達量在各濃度TNF-α作用下都無明顯改變。提示了低濃度的TNF-α可以促進EAAT2的表達，并且這種促進作用不是歸因于膠質(zhì)細胞的增生。
　　 (2)星形膠質(zhì)細胞經(jīng)10ng/ml的TNF-α孵育，在孵育24h以內(nèi)，EAAT2的蛋白表達量隨孵育時間逐漸增高，其中在孵育8h，12h和24h后均能顯著促進EAAT2

6、的表達；而隨著TNF-α更長時間的孵育(≥24h)，EAAT2的表達從高峰又逐漸下降。GFAP蛋白表達量在TNF-α作用的各時間點都無明顯差異。提示了TNF-α孵育早期可以促進EAAT2的表達，而長時間的TNF-α孵育反而會抑制EAAT2的表達，這種促進或抑制作用不是歸因于膠質(zhì)細胞的增生。
　　 (3)OGD嚴重損傷了神經(jīng)元。但是星形膠質(zhì)細胞經(jīng)低濃度TNF-α短期孵育，采用倒扣混合培養(yǎng)法增強了神經(jīng)元對OGD損傷的抵抗作用，但保護

7、作用的時間點與EAAT2表達增強的時間點并不吻合。
　　 (4)OGD條件下，星形膠質(zhì)細胞經(jīng)不同濃度的TNF-α短時孵育后，EAAT2表達量僅輕度升高，升高程度不及非OGD條件下的顯著，并且，EAAT2表達的升高伴隨著GFAP表達的升高。說明OGD條件下，TNF-α并不能有效升高EAAT2的表達，它增強OGD后神經(jīng)元的抵抗作用可能不完全歸因于它對EAAT2的調(diào)控作用。
　　 結(jié)論
　　 低濃度的TNF-α短時孵育