T3對(duì)2VO大鼠側(cè)腦室下區(qū)新生神經(jīng)元增殖和存活率的影響.pdf

1、目的：血管性癡呆(vascular dementia，VaD)是一組由腦血管疾病導(dǎo)致的智能及認(rèn)知功能障礙綜合征，是僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的引起癡呆的第二大最常見(jiàn)原因。Bowler等學(xué)者在90年代提出了血管性認(rèn)知功能障礙(vascular cognitive impairment，VCI)的概念，以期在腦血管病的早期階段發(fā)現(xiàn)輕度的認(rèn)知功能障礙，制定合適的治療方案，延緩癡呆的發(fā)展進(jìn)程。VCI這一概

2、念幾乎包含了腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)對(duì)認(rèn)知功能影響的方方面面，涵蓋了早期階段認(rèn)知功能某一方面如語(yǔ)言的輕度障礙到廣泛認(rèn)知功能損害的癡呆綜合征。隨著我國(guó)老齡化人口的快速進(jìn)展，VaD的發(fā)病率和患病率明顯增加，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，但迄今為止，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，故缺乏有效的預(yù)防和治療手段。因此，積極地探索和研究VaD的發(fā)病機(jī)理已成為當(dāng)務(wù)之急。目前的研究結(jié)果表明，VaD的藥物治療及預(yù)防效果

3、不明確。研究發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物并沒(méi)有提高腦缺血患者的腦血管反應(yīng)性。另外，與安慰劑相比，阿司匹林和降壓藥對(duì)癡呆的發(fā)生發(fā)展并沒(méi)有明顯的延緩作用。相比與藥物治療，近幾十年基于干細(xì)胞技術(shù)的細(xì)胞替代治療引起了廣泛的關(guān)注。在一項(xiàng)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ挽o脈輸注人類(lèi)骨髓CD34+干細(xì)胞，可以促進(jìn)缺血病灶周?chē)律艿男纬桑瑫r(shí)也促進(jìn)了內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞的遷移、成熟和功能性恢復(fù)。外源性干細(xì)胞替代治療為腦缺血后的神經(jīng)功能恢復(fù)提供了廣闊的前景，但

4、是對(duì)于其應(yīng)用于臨床治療還需更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持，特別是長(zhǎng)期的安全性和細(xì)胞采集以及輸注等技術(shù)性關(guān)鍵問(wèn)題還有待于進(jìn)一步的研究。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的研究表明許多因素可以影響成年腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)再生，一些生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)可以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、遷移、分化和存活，改善腦缺血等損傷所致的神經(jīng)功能障礙，為今后利用內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞作為細(xì)胞替代治療提供了可能，可以避免外源性細(xì)胞替代治療所帶來(lái)的安全性考慮和技術(shù)性難題。腦缺血后海馬和側(cè)腦室的神經(jīng)再生是國(guó)內(nèi)外

5、的研究熱點(diǎn)，對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞的存活、增殖和分化的基因調(diào)控的研究是該領(lǐng)域研究的核心問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道稱，中藥湯劑（人參養(yǎng)榮湯）、左旋丁苯酞、蒿本內(nèi)酯等能促進(jìn)海馬齒狀回(Dentate gyrus，DG)的顆粒細(xì)胞層下區(qū)(Subgranularzone，SGZ)的神經(jīng)再生，使雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)(bilateral permanent occlusion of the commoncarotid arteries，2VO)所

6、致大鼠慢性腦缺血模型Morris水迷宮測(cè)試潛伏期顯著縮短，從而改善慢性腦缺血所致認(rèn)知功能障礙。雖然海馬神經(jīng)祖細(xì)胞可以從SGZ向顆粒細(xì)胞層遷移，但海馬新生神經(jīng)元在早期就到達(dá)它們最終的位置，新生細(xì)胞最遠(yuǎn)的遷移距離在50-100um范圍內(nèi)，而大部分似乎根本不遷移，仍然停留在SGZ，不能直接參與海馬CA1神經(jīng)元損傷修復(fù)。因此國(guó)內(nèi)外的研究加強(qiáng)了對(duì)遷移能力較強(qiáng)的側(cè)腦室背外側(cè)壁的室下區(qū)(Subventricularzone，SVZ)的神經(jīng)祖細(xì)胞的研究

7、。以往研究表明，在正常嚙齒動(dòng)物的大腦，SVZ新生神經(jīng)元大部分都凋亡了，存活下來(lái)的新生神經(jīng)元沿著RMS(rostral migratory stream)遷移路徑到達(dá)嗅球，并分化為球旁細(xì)胞和GABAergic顆粒細(xì)胞。但在腦缺血等損傷刺激下，側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)祖細(xì)胞可以明顯增多，并且可以向損傷部位遷移，分化為損傷部位的特定的神經(jīng)元，但腦缺血等損傷所致的微環(huán)境的變化使得新生神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)障礙，不能有效地整合入損傷部位的神經(jīng)電路參與功能修復(fù)

8、，但這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)障礙可以在FGF-2等生長(zhǎng)因子干預(yù)下恢復(fù)，提示腦缺血后功能缺陷的新生神經(jīng)元能在外源性因素干預(yù)下恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，并發(fā)揮功能性作用，改善腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙。因此急需尋找有效的手段促進(jìn)SVZ神經(jīng)祖細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，提高其存活率，促進(jìn)新生神經(jīng)元向損傷部位遷移，從而增加利用內(nèi)源性神經(jīng)祖細(xì)胞作為細(xì)胞替代治療的機(jī)會(huì)，有效地改善損傷所致的神經(jīng)功能障礙。血管性癡呆(VaD)患者血清三碘甲狀腺原氨酸(T3)和游離三碘甲狀腺原氨

9、酸(fT3)濃度顯著低于未癡呆患者，而且輕、中、重度不同程度血管性癡呆患者之間血清T3和fT3水平也有顯著差異，與阿爾茨海默病(AD)患者相比，VaD患者的fT3水平也顯著降低，非癡呆型血管性認(rèn)知障礙(VCIND)患者的血清四碘甲狀腺原氨酸(T4)和游離四碘甲狀腺原氨酸(fT4)水平顯著低于腦血管疾病(CVD)患者，CVD患者的血清T4和fT4水平顯著低于具有腦血管病危險(xiǎn)因素的正常對(duì)照組，以上研究結(jié)果共同提示，血清甲狀腺激素水平的異常與

10、血管性癡呆的進(jìn)行性發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)，而且可能在腦血管病發(fā)生但未導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的早期階段就有血清甲狀腺激素水平的異常，加強(qiáng)甲狀腺激素與血管性癡呆之間關(guān)系以及機(jī)制等進(jìn)一步的研究很有意義，可能為今后血管性癡呆的早期臨床診斷和治療提供線索。甲狀腺激素(THs)對(duì)哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育成熟至關(guān)重要，影響胚胎腦內(nèi)神經(jīng)元的增殖、分化，軸樹(shù)突生長(zhǎng)，髓鞘形成等各個(gè)過(guò)程。近年來(lái)THs對(duì)成年大腦的影響備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)THs水平異常嚴(yán)重影響成年大腦SG

11、Z和SVZ兩個(gè)區(qū)域神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、遷移、分化等過(guò)程，提示成年甲狀腺功能低下所致的認(rèn)知功能障礙可能與THs影響SGZ和SVZ兩個(gè)區(qū)域的神經(jīng)再生有關(guān)。多項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)基因敲除模型和MMI/PTU導(dǎo)致的甲狀腺功能低下模型的研究發(fā)現(xiàn)，不管是在胚胎和幼年大腦，還是對(duì)于成年大腦而言，甲狀腺素的缺乏可以影響神經(jīng)元的增殖、分化、遷移和凋亡等各個(gè)方面，使軸突樹(shù)突生長(zhǎng)、突觸形成和髓鞘形成等過(guò)程受損，而重新補(bǔ)充甲狀腺激素可以逆轉(zhuǎn)甲狀腺素缺乏的負(fù)性作用，但甲狀

12、腺激素(THs)對(duì)腦缺血后SVZ神經(jīng)再生的影響未見(jiàn)報(bào)道。課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血大鼠腦組織T3和T4濃度顯著下降，外源性補(bǔ)充甲狀腺素能顯著提高腦組織T3和T4的濃度，明顯縮短慢性腦缺血大鼠Morris水迷宮的潛伏期，改善其學(xué)習(xí)記憶能力;進(jìn)一步對(duì)慢性腦缺血大鼠急性期腹腔注射T3即時(shí)干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室下區(qū)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，提示T3可促進(jìn)SVZ神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖，但長(zhǎng)期作用對(duì)慢性腦缺血大鼠側(cè)腦室下區(qū)的神經(jīng)再生的影響尚不清楚。

13、本課題擬采用成年大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)制備慢性腦缺血致血管性認(rèn)知障礙的動(dòng)物模型，對(duì)慢性腦缺血大鼠設(shè)置三碘甲狀腺原氨酸(T3)連續(xù)7天和14天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的干預(yù)處理，通過(guò)腹腔注射BrdU標(biāo)記增殖細(xì)胞，選擇內(nèi)源性細(xì)胞標(biāo)記物DCX，通過(guò)BrdU和DCX免疫熒光雙重標(biāo)記側(cè)腦室下區(qū)新生的未成熟神經(jīng)元，同時(shí)采用免疫印跡法檢測(cè)側(cè)腦室下區(qū)DCX蛋白的表達(dá)水平，觀察T3對(duì)SVZ神經(jīng)再生的影響。
　　 方法：⑴實(shí)驗(yàn)分組:48只雄性SD大鼠隨機(jī)分

14、為假手術(shù)組，2VO組和缺血后三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine，T3)干預(yù)組，每組8只。2VO組采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎術(shù)(2VO)制備慢性腦缺血致血管性認(rèn)知障礙動(dòng)物模型。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余與慢性腦缺血組手術(shù)過(guò)程相同。缺血后T3干預(yù)組于雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后次日起給予T3，10 ug/30g BodyWeight，1次/天，連續(xù)注射7天和14天后，分別處死。假手術(shù)組和2VO組大鼠給予腹腔注射生理鹽水，劑

15、量同T3干預(yù)組，1次/天，連續(xù)注射7天和14天后，分別處死。術(shù)后各組大鼠連續(xù)腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記增殖細(xì)胞，50 mg/kg BodyWeight，2次/天，連續(xù)7天。⑵各組5只大鼠分別于第7、14天灌注取腦組織，采用BrdU與Doublecortin(DCX)免疫熒光雙染法標(biāo)記新生神經(jīng)元;⑶各組3只大鼠分別于第7、14天取新鮮腦組織冰上分離SVZ，采用免疫印跡法(W

16、estern blotting)檢測(cè)DCX蛋白的表達(dá)水平。⑷免疫熒光染色計(jì)數(shù)以一個(gè)對(duì)實(shí)驗(yàn)分組全盲的觀察者對(duì)SVZ BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)結(jié)果為主。每組5只大鼠，每只大鼠隔8張切片留取1張進(jìn)行染色，每只大鼠共計(jì)數(shù)6張切片的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)總數(shù)的8倍作為最后細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差(one-way ANOVA)分析，組間多重比較采用LSD

17、法，以P＜0.05定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：①免疫熒光雙重染色可見(jiàn)缺血7天后，假手術(shù)組、2VO組和T3干預(yù)組BrdU、DCX陽(yáng)性細(xì)胞都在SVZ表達(dá)，沿SVZ分布，三組都可見(jiàn)部分BrdU陽(yáng)性細(xì)胞不表達(dá)DCX，部分DCX陽(yáng)性細(xì)胞也不表達(dá)BrdU。缺血后T3干預(yù)組BrdU和BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞與假手術(shù)組和2VO組相比，在側(cè)腦室的表達(dá)增多。免疫印跡法顯示T3給藥7天后:與假手術(shù)組比較，2VO組、缺血后T3干預(yù)組DCX蛋白水平

18、三組間呈遞增趨勢(shì)，缺血后T3干預(yù)組增多明顯。②缺血14天后，免疫熒光雙重染色顯示:T3干預(yù)組與假手術(shù)組和2VO組相比，缺血后T3干預(yù)組BrdU和BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞在側(cè)腦室的表達(dá)仍增多。2VO14天組BrdU、DCX熒光強(qiáng)度較2VO7天組顯著減弱;免疫印跡法顯示2VO組DCX蛋白水平降低較明顯，缺血后T3干預(yù)組DCX蛋白表達(dá)仍高于假手術(shù)組和2VO組。③為了進(jìn)一步量化各組間的差異，我們對(duì)免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)行了細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，缺

19、血7天后，T3干預(yù)組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞較假手術(shù)組顯著增多(P=0.002)，較2VO組增多，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.084)。缺血14天后，T3干預(yù)組與假手術(shù)組和2VO14天組相比，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(P＜0.01)。2VO14天組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)降低到2VO7天組的58.2％，兩組相比有顯著性差異(P=0.013)。缺血后T3干預(yù)14天組與缺血后T3干預(yù)7天組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異。④我們對(duì)BrdU/DCX雙重?zé)晒鈽?biāo)記細(xì)

20、胞計(jì)數(shù)的結(jié)果顯示，假手術(shù)組、2VO7天組、缺血后T3干預(yù)7天組BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為1502.4±252.6，2636.8±364.6，4316.8±529.9個(gè)，組間比較有顯著性差異(F=12.60，P=0.001)，缺血后T3干預(yù)7天組較2VO7天組和假手術(shù)組顯著增多(P=0.012，P＜0.001)。與假手術(shù)組和2VO14天組相比，缺血后T3干預(yù)14天組BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.001)。2VO14天組

21、BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞為2VO7天組的54.0％，兩組相比有顯著性差異(P=0.008)。缺血后T3干預(yù)14天組與缺血后T3干預(yù)7天組BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞無(wú)顯著性差異。
　　 結(jié)論：⑴在本實(shí)驗(yàn)中，缺血7天后，T3干預(yù)組SVZ BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組和2VO7天組顯著增多，雖然腦缺血損傷也能刺激SVZ BrdU陽(yáng)性細(xì)胞和BrdU/DCX陽(yáng)性細(xì)胞的增多，但這種代償作用與假手術(shù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示了外源性補(bǔ)充甲